在大肠杆菌蛋白表达实验中,我们经常会遇到蛋白表达不出来、表达出的蛋白没有活性、蛋白表达过程中容易形成包涵体等情况,还要分析出现这些情况的原因。1、目的蛋白不适合在大肠杆菌中表达。包括稀有密码子、mRNA结构、跨膜区等;2、表达条件需要进一步优化。比如温度、分子伴侣、适合的表达宿主等;3、采用哪种温和复性条件可以提高蛋白活性,减少包涵体的形成等等。

除此之外,几乎每出一点差错就需要重新开始实验,表达载体的构建、感受态细胞的转化、阳性*的鉴定、培养基的配制、小量诱导摸条件、大量诱导、离心富集细胞、超声裂解细胞、亲和富集与纯化。又需要额外花费一周、几周甚至半年的时间,时间成本高到让人心烦不已。

现在有一个新技术，Biotechrabbit无细胞体外蛋白表达系统——合成生物学的福音

无细胞蛋白合成系统（cell-free protein synthesis system），也叫做体外（in vitro）蛋白表达系统，本系统中包含转录、翻译的全部元件，如T7 RNA聚合酶、核糖体，折叠元件等，加上核酸模板（DNA或者mRNA），无需活细胞即可以进行蛋白合成。

无细胞蛋白合成系统（cell-free protein synthesis system），也叫做体外（in vitro）蛋白表达系统，本系统中包含转录、翻译的全部元件，如T7 RNA聚合酶、核糖体，折叠元件等，加上核酸模板（DNA或者mRNA），无需活细胞即可以进行蛋白合成（图1）。

图1：体外蛋白表达原理图。

一、无细胞蛋白合成系统优势：

1. 特异性好：只有目标蛋白才会被合成，合成产物无需进行复杂的纯化步骤。

2. 不含核酸酶和蛋白酶。

3. 省时间，操作简单：

 ·无需细胞的转化，培养和诱导；

 ·适用于质粒和PCR扩增合成的线状DNA模板；

4. 克服蛋白毒性：即使对宿主细胞有毒性的蛋白也可以顺利合成。

5. 系统灵活性：

 ·可对合成系统进行个性化调整：自行添加chaperones，去垢剂，修饰酶等其他添加物；

 ·可实现高通量的模板和合成条件的筛选，大大节省时间和精力。

图2：体外和体内蛋白合成方法的实验流程比较。

Biotechrabbit产品技术亮点：

来自德国的生产商Biotechrabbit所提供的快速蛋白表达系统（Rapid translation system, RTS），在传统的体外蛋白合成方法基础上进行了升级，通过以下两个关键技术大大改善了体外蛋白合成的效率：

1. 无细胞持续交换系统（Continuous Exchange Cell-Free, CECF）

通过持续补充蛋白合成所需的底物和能量，并不断吸收对蛋白合成反应有抑制作用的副产物，来延长合成反应的持续时间。

图3：CECF技术原理图。

2. 特殊的能量供给方法High yield (HY) biochemistry：

配合优化的缓冲液配方，以糖酵解的方式为持续长时间的合成反应提供稳定足够的能量。

图4：不同方法的体外蛋白合成系统得率对比。红色线为传统产品，蓝色和绿色线分别为Biotech的CECF技术和CECF加HY技术的产品。

RTS产品：

目前为止，Biotechrabbit所提供的RTS有三种不同宿主细胞来源的产品，分别是大肠杆菌E. Coli，昆虫细胞和麦芽细胞。常用的E. Coli来源试剂盒以冻干粉形式提供，易于储存和运输。不同大小规格可满足科研用户和工业用户的不同产量需求：

1. RTS E. coli 100 HY

 BR1400101, 24 rxn

 BR1400102, 96 rxn

 高通量形式助你快速筛选最合适的质粒和*表达系统，适合环状和线状DAN模板。

2. RTS 500 E. Coli ProteoMaster HY

 BR1400201, 5 rxn, 1ml, 6mg

 中等规模反应，适合环状DAN模板。

3. RTS 9000 E. coli HY

 BR1400301, 1 rxn, 10ml, 50mg

 中等规模反应，适合环状DAN模板。

4. 除此以外，还有二硫化蛋白合成试剂盒RTS E. coli Disulfide kits

 BR1400401, 24 rxn, 50µl

 BR1400501, 5 rxn, 1 ml

 适合需要表达具有空间结构的蛋白质

上海金畔代理Biotechrabbit的全线产品，包括无细胞蛋白表达产品，冻干粉形式的PCR/qPCR mix。

上海金畔ImmunoPrecise蛋白质产品2021年价格表

invivogen提供了广泛的试剂，工程细胞系和测定试剂盒，可满足您对先天免疫和哺乳动物细胞表达的研究需求。

对于细胞培养，我们提供微生物污染的解决方案，以及选择性抗生素和内毒素检测试剂盒。

我们还提供了一个扩展的报告细胞系集合，以监测由细胞因子或模式识别受体（PRR）配体诱导的细胞内信号传导途径。

对于主要的PRR信号通路，我们提供相关配体，抑制剂和抗体的家族。

此外，我们提供了多种人类和鼠类基因，细胞启动子以及用于不同应用的克隆和表达载体的选择。

细胞转染

用表达GFP的质粒转染THP-1细胞

细胞转染包括将“外源”核酸（例如质粒或siRNA）引入细胞中，以分别过表达或沉默目的基因。转染可以在各种细胞环境中对特定基因的表达进行功能评估。根据核酸的类型以及细胞的类型，可以使用许多不同的转染方案。转染的三种主要方法是化学的（例如阳离子脂质），物理的（例如电穿孔）和生物的（例如病毒转导）。新引入的核酸可以是瞬时存在的，从而该基因仅在有限的时间段内表达而不能复制，也可以稳定地存在，由此该基因整合到受体细胞的基因组中。细胞转染后 

仍难以转染的细胞（例如免疫细胞）通常会表达能检测外源核酸的强效胞质传感器。因此，需要转染增强剂或加强剂来禁用这些防御，从而有助于促进核酸表达并大大提高转染成功率。

InvivoGen提供：

• LyoVec™：一种专有的基于阳离子脂质的转染试剂，属于磷脂家族。它很容易用于许多细胞系的转染，例如人类胚胎肾-293（HEK-293）细胞系。
   
• NATE™：一种核酸转染增强剂，可提高瞬时和稳定转染效率。它被设计与转染试剂和推荐用于难以转染的细胞（例如人单核细胞和鼠巨噬细胞（分别为THP-1和RAW 264.7））一起使用的技术结合使用。 
   
• 选择性抗生素：范围广泛的高纯度和无内毒素的选择性抗生素，包括弹性蛋白，Zeocin™，嘌呤霉素，G418，潮霉素B金和菌霉素。它们可用于在哺乳动物和细菌细胞中进行选择 。

invivogen LyoVec说明书

所有West Bioscience定制的蛋白表达和纯化均在我们的加利福尼亚工厂进行，以确保高的质量和的客户满意度。我们一直是提供高质量重组蛋白表达和纯化服务的，尤其是在定制蛋白设计领域。我们向客户交付了数千种蛋白质。

 westbioscience大肠杆菌系统的优缺点

 优点

• 表达水平可能很高
• 低成本
• 快速增长
• 可扩展
• 简单的转换协议
• 可以更改许多参数以优化表达式

 缺点

• 低效的二硫键形成
• 蛋白在细胞质中折叠不良
• 包涵体形成
• 体外重折叠方案效率低下–可能会抵消优势
• 密码子的用法不同于真核生物
• 少的翻译后修饰
• 内毒素

克隆

我们将通过标准亚克隆或PCR克隆将您的插入片段克隆到表达载体中。  将用于将目的基因转移到表达载体中。将对克隆进行*排序以进行验证。

 表达筛选

含有目的基因的表达载体将被转化到大肠杆菌的表达菌株中以产生蛋白质。几个单独的克隆将在小规模的诱导实验中进行筛选。表达结果将通过SDS / PAGE和蛋白质印迹进行分析。

 表达优化

表达条件将通过诱导时间，温度和培养基条件来优化。结果将通过SDS-PAGE和Western blot确认。

 蛋白质表征

将测试小规模的培养物，并对表达的蛋白质进行表征，以区分纯化标签的细胞位置，溶解度，产量和可及性。将设计生产和纯化蛋白质的详细策略。

 蛋白质生产

使用摇瓶将以升量进行大规模生产。如果您喜欢自己纯化蛋白质，则将收到细胞沉淀物以及带有SDS-PAGE和Western blot分析结果的完整报告。

 蛋白质纯化

可以使用多种方法纯化蛋白质，例如包涵体制备或亲和柱纯化。

Oxford Expression Technologies是杆状病毒蛋白表达系统的专家。我们所有的产品都经过优化，以确保快速，直接的重组病毒生产和蛋白质表达。我们的在线商店提供了您可能需要的一切，从革命性的 Flash BAC™杆状病毒表达载体和杆状病毒qPCR滴定试剂盒，到转染试剂和转移质粒。

OET提供了广泛的杆状病毒重组蛋白表达产品，可通过使用flash BAC™或线性DNA BacPAK6系统支持昆虫或哺乳动物细胞中的成功基因表达和蛋白生产。除此之外，我们还提供病毒滴定试剂盒，转染试剂，测序引物和我们的入门包baculo COMPLETE，其中包含开始重组蛋白生产所需的一切。

什么是Flash BAC™杆状病毒表达系统？

所述闪光灯BAC™表达系统利用来自已被遗传优化以函数作为重组蛋白表达载体的杆状病毒基因组DNA。该系统提供高产量的优质蛋白质，易于使用，并且还与基于同源重组的大多数转移载体反向兼容。通过这种方式，flashBAC™系统已成为那些需要在昆虫细胞中以及通过BacMAM系统在哺乳动物细胞中实现蛋白质表达的人的表达。基因修饰不仅可以防止亲代病毒复制，而且可以优化难表达蛋白的表达。

oetltd 100150说明书

SKU：100150 类别：flashBAC™杆状病毒表达系统 标签：杆状病毒，杆状病毒表达，重组蛋白表达

SKU：N / A 类别：flashBAC™杆状病毒表达系统 标签：杆状病毒，杆状病毒表达，重组蛋白表达

产品描述

 对于要表达的基因可能很简单并且靶向感染细胞的细胞质或细胞核的项目，原始的Flash BAC™载体 （目录号100150/100151/100152）是一个不错的选择。该闪光灯BAC  ™系统建立在BacPAK6技术。新系统的核心是AcMNPV基因组，该基因组缺少必需基因ORF 1629的一部分，并在pohl位点包含细菌人工染色体（BAC），取代了polh编码序列。基本基因缺失可防止病毒在昆虫细胞中复制，而BAC可使病毒基因组以杆状病毒的形式维持在细菌细胞中。只需通过将昆虫细胞与flash BAC™DNA和含有待表达基因的兼容转移质粒。昆虫细胞内的同源重组可去除BAC序列，在polh启动子的控制下插入外源基因，并恢复ORF 1629，从而使重组病毒得以复制。

与其他杆状病毒表达系统相比，使用flash BAC™系统更容易，更快捷，因为不需要通过噬菌斑纯化或任何其他手段将重组病毒与亲本病毒分开；共转染后仅产生重组病毒。由于重组病毒的生产已减少到昆虫细胞中的一步步骤，因此适合高通量和自动化的生产系统。然而，这对于需要低成本解决方案以生产在单个细胞培养皿中制备的一种或几种重组杆状病毒的小型研究小组也是有益的。

全长IgG抗体，F（ab）和（Fab'）2抗体片段以及抗体融合蛋白的表达和纯化。我们的抗体生产能力包括构建体设计，瞬时哺乳动物细胞表达，利用内部或客户提供的表达载体以及亲和纯化。我们提供分子和酶促方法来生成F（ab）和（Fab'）2抗体片段。

抗体生产

Proteos提供全长IgG抗体，F（ab）和（Fab'）2抗体片段以及抗体融合蛋白的生产。我们的抗体生产能力包括构建体设计，利用内部或客户提供的表达载体进行瞬时哺乳动物细胞表达以及亲和纯化。提供的其他纯化服务包括在一次生产运行中多10克抗体的尺寸排阻色谱，通过透析进行的缓冲液交换，内毒素测试，分析SEC和SDS-PAGE（还原和非还原）。

我们行业的瞬态表达平台利用表达Epstein-Barr病毒（EBV）核抗原1的*的HEK（人类仓鼠卵巢）和CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系，以及包含EBV复制起点（OriP）的专有表达载体允许游离质粒扩增和高水平重组蛋白表达。

我们还提供细胞系扩增，冷冻保存和客户提供的细胞系库。总库将专门为客户的瞬时或稳定蛋白质生产项目而维护，并将根据其要求销毁或退还。

我们利用经过优化和经过充分验证的哺乳动物细胞表达方案，在无血清摇瓶培养体积为30 mL至60 L批次大小的情况下获得一致，可再现的蛋白表达。仅无支原体，高存活率，低传代培养用于转染，并使用Beckman Coulter Vi-cell XR监测培养密度，存活率和平均细胞直径。Vi-cell XR使用锥虫蓝染料排除方法，平均50次测量结果以计算每个样品的参数。这使我们能够高度准确地监测培养，这对于蛋白质生产项目的质量和可重复性至关重要。每个项目随附的定制技术报告中均包含所有细胞培养数据。

从构建体设计开始，抗体生产的典型生产时间为6-8周。  

全面的生产服务：

• 全套分子生物学服务可与我们的任何表达平台一起提供，包括构建体设计，融合伴侣和亲和标签选择，带有密码子优化的基因合成，亚克隆，无内毒素质粒DNA分离和序列验证。
• 在小于100 mL的培养规模上进行表达验证和优化；非常适合并行表达测试多种抗体。
• 以30毫升的培养规模平行生产8组抗体的中等通量生产。多可以并行生产48个抗体。
• 在1 L至4 L的培养规模上进行中试规模生产和产量测定；大规模生产之前通过纯化进行过程验证的理想选择。
• 在摇瓶培养体积不超过60 L的HEK或CHO细胞中制备规模的重组全长IgG，抗体片段或抗体融合蛋白。
• 抗体表达服务可以与Proteos的纯化服务结合使用，以实现*定制的蛋白质生产过程。

其他抗体服务：

• 酶促处理全长IgG以生产F（ab）或F（ab'）2抗体片段
• 从血清，腹水或其他BSL-1生物体液中纯化IgG
• 抗体同型测定
• 抗体标记（HRP，生物素，FITC等）
• 抗原产生 

proteos哺乳动物细胞表达

Proteos可在哺乳动物细胞中表达重组蛋白和抗体，包括适当的翻译后修饰。这些翻译后修饰通常是有效分泌和功能所必需的，这就是为什么在需要生物功能蛋白的情况下，优选哺乳动物细胞生产的原因。

我们行业的瞬态表达平台利用表达Epstein-Barr病毒（EBV）核抗原1的*的HEK（人类仓鼠卵巢）和CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系，以及包含EBV复制起点（OriP）的专有表达载体允许游离质粒扩增和高水平重组蛋白表达。

我们还可以在客户提供的细胞系中提供细胞系扩增，储存和瞬时表达。

我们经过优化和充分验证的哺乳动物细胞表达方案可在无血清摇瓶培养体积为每批30 mL至60 L的范围内提供一致，可再现的蛋白质表达。仅使用无支原体，高存活率，低传代培养物进行转染，并使用Beckman Coulter Vi-CELL XR监测其培养物密度，存活率和平均细胞直径。Vi-CELL XR使用锥虫蓝染料排除方法，平均50次测量值以计算每个样品的参数。这使我们能够高度准确地监测培养，这对于蛋白质生产项目的质量和可重复性至关重要。每个项目随附的定制技术报告中均包含所有细胞培养数据。

从构建体设计到纯化的蛋白质，典型的生产时间为6-8周。

服务包括：

• 全套分子生物学服务可与我们的任何表达平台一起提供，包括构建体设计，融合伴侣和亲和标签选择，带有密码子优化的基因合成，亚克隆，无内毒素质粒DNA分离和序列验证。
• 在小于100 mL的培养规模上进行表达验证和优化；并行测试多个重组蛋白靶标的理想选择。
• 在1 L至4 L的培养规模上进行中试规模生产和产量测定；大规模生产之前通过纯化进行过程验证的理想选择。
• 在摇瓶培养物中，HEK或CHO细胞中重组蛋白的制备规模生产，批量大可达到60L。
• 交付选项包括细胞糊剂，条件培养上清液，浓缩缓冲液交换的培养上清液或膜制剂。
• 哺乳动物细胞表达服务可以与Proteos的纯化服务结合使用，以实现*定制的蛋白质生产过程。