在大肠杆菌蛋白表达实验中,我们经常会遇到蛋白表达不出来、表达出的蛋白没有活性、蛋白表达过程中容易形成包涵体等情况,还要分析出现这些情况的原因。1、目的蛋白不适合在大肠杆菌中表达。包括稀有密码子、mRNA结构、跨膜区等;2、表达条件需要进一步优化。比如温度、分子伴侣、适合的表达宿主等;3、采用哪种温和复性条件可以提高蛋白活性,减少包涵体的形成等等。

 

除此之外,几乎每出一点差错就需要重新开始实验,表达载体的构建、感受态细胞的转化、阳性*的鉴定、培养基的配制、小量诱导摸条件、大量诱导、离心富集细胞、超声裂解细胞、亲和富集与纯化。又需要额外花费一周、几周甚至半年的时间,时间成本高到让人心烦不已。

现在有一个新技术，Biotechrabbit无细胞体外蛋白表达系统——合成生物学的福音

无细胞蛋白合成系统（cell-free protein synthesis system），也叫做体外（in vitro）蛋白表达系统，本系统中包含转录、翻译的全部元件，如T7 RNA聚合酶、核糖体，折叠元件等，加上核酸模板（DNA或者mRNA），无需活细胞即可以进行蛋白合成。

无细胞蛋白合成系统（cell-free protein synthesis system），也叫做体外（in vitro）蛋白表达系统，本系统中包含转录、翻译的全部元件，如T7 RNA聚合酶、核糖体，折叠元件等，加上核酸模板（DNA或者mRNA），无需活细胞即可以进行蛋白合成（图1）。

图1：体外蛋白表达原理图。

一、无细胞蛋白合成系统优势：

1. 特异性好：只有目标蛋白才会被合成，合成产物无需进行复杂的纯化步骤。

2. 不含核酸酶和蛋白酶。

3. 省时间，操作简单：

 ·无需细胞的转化，培养和诱导；

 ·适用于质粒和PCR扩增合成的线状DNA模板；

4. 克服蛋白毒性：即使对宿主细胞有毒性的蛋白也可以顺利合成。

5. 系统灵活性：

 ·可对合成系统进行个性化调整：自行添加chaperones，去垢剂，修饰酶等其他添加物；

 ·可实现高通量的模板和合成条件的筛选，大大节省时间和精力。

 

图2：体外和体内蛋白合成方法的实验流程比较。

Biotechrabbit产品技术亮点：

来自德国的生产商Biotechrabbit所提供的快速蛋白表达系统（Rapid translation system, RTS），在传统的体外蛋白合成方法基础上进行了升级，通过以下两个关键技术大大改善了体外蛋白合成的效率：

1. 无细胞持续交换系统（Continuous Exchange Cell-Free, CECF）

通过持续补充蛋白合成所需的底物和能量，并不断吸收对蛋白合成反应有抑制作用的副产物，来延长合成反应的持续时间。

图3：CECF技术原理图。

2. 特殊的能量供给方法High yield (HY) biochemistry：

配合优化的缓冲液配方，以糖酵解的方式为持续长时间的合成反应提供稳定足够的能量。

图4：不同方法的体外蛋白合成系统得率对比。红色线为传统产品，蓝色和绿色线分别为Biotech的CECF技术和CECF加HY技术的产品。

RTS产品：

目前为止，Biotechrabbit所提供的RTS有三种不同宿主细胞来源的产品，分别是大肠杆菌E. Coli，昆虫细胞和麦芽细胞。常用的E. Coli来源试剂盒以冻干粉形式提供，易于储存和运输。不同大小规格可满足科研用户和工业用户的不同产量需求：

1. RTS E. coli 100 HY

 BR1400101, 24 rxn

 BR1400102, 96 rxn

 高通量形式助你快速筛选最合适的质粒和*表达系统，适合环状和线状DAN模板。

 

2. RTS 500 E. Coli ProteoMaster HY

 BR1400201, 5 rxn, 1ml, 6mg

 中等规模反应，适合环状DAN模板。

 

3. RTS 9000 E. coli HY

 BR1400301, 1 rxn, 10ml, 50mg

 中等规模反应，适合环状DAN模板。

 

4. 除此以外，还有二硫化蛋白合成试剂盒RTS E. coli Disulfide kits

 BR1400401, 24 rxn, 50µl

 BR1400501, 5 rxn, 1 ml

 适合需要表达具有空间结构的蛋白质

 

上海金畔代理Biotechrabbit的全线产品，包括无细胞蛋白表达产品，冻干粉形式的PCR/qPCR mix。