LipiORDER (Membrane Lipid Order Imaging Dye)
可定量观察活细胞的膜相态！
- 产品特性
- 相关资料
- Q&A
- 参考文献
可定量观察活细胞的膜相态！
LipiORDER ＜Membrane Lipid Order Imaging Dye＞
LipiORDER是环境响应型的荧光色素，可通过成像生物膜的相态 (Lipid order）Lo/Ld实现定量观察。即使在活细胞中也显示高度化学稳定性，且可观察到各种膜结构的相态，如细胞膜、细胞内膜等。
※ 本产品由funakoshi 株式会社基于高知大学教育研究部综合科复合领域科学部门 仁子阳辅博士的研究成果商品化并销售。
※ 本产品仅供研究，研究以外不可使用。
LipiORDER成像和神经细胞染色示例
依赖生物膜相态的本试剂的荧光特性变化（左）和神经细胞神经突起部位的染色案例（右）
◆生物膜相态(Lipid order)是什么？
构成生物膜的脂质种类繁多，膜的状态因其脂质组成而大不同。例如，仅由饱和脂肪酸构成的脂质膜因密度高且包裹坚固的特点，被称为有序相（Lo）；由含有不饱和脂肪酸脂质构成的脂质膜因密度低，被称为无序相（Ld）。像这样的脂质微环境被称为相态（Lipid order)。在简单模型中，Lo和Ld分离并发生明确的相分离（如图），但由于细胞生物膜中的脂质种类繁多，不会发生图中模型所示的简单相分离，而是反映总和性质的相态。
另外，膜蛋白的存在也被认为会影响相态，而实际细胞膜上的相态更为复杂。细胞膜上的Lo有时也被称为脂筏（Lipid raft），作为生物膜的功能域备受关注。这种脂质膜相态的观察对于理解膜的生物物理学性质（如生物膜的流动性和硬度等）非常重要，期待未来能开发出针对它的分析方法。
脂质膜的相态成像
近年，Laurdan、di-4-ANEPPDHQ、Nile Red等响应分子极性并发生色调变化的荧光色素（solvatochomic dye) 已被应用于生物膜的相态可视化。由于这些分子极性响应型荧光色素会根据相态改变荧光波长，通过检测特定激发光中的两种波长的荧光获得其荧光强度比，可半定量分析相态。（详细信息，请参阅下述的“原理”）。
然而，这些试剂在实际使用中还存在如细胞内局部不均匀、对光不稳定等问题，。本产品LipiORDER利用高知大学的仁子阳辅博士和Strasbourg大学的Andrey Kylmchenko博士的团队开发的新型芘衍生物荧光探针（原著论文名PK），以及在Lo、Ld上荧光特性不同的特征，可定量分析生物膜相态。与Laurdan相比，显示极高的光稳定性，在活细胞中也能维持化学稳定性，因此活细胞成像优异。
参考：膜的相态成像应用实例
相态被认为是决定脂质膜流动性的参数，以Laurdan为首，相态成像被用于各种生命现象的分析。Laurdan会根据相态将荧光波长由蓝色（Lo）变为绿色（Ld），观察蓝色和绿色两种波长的荧光，其荧光强度比（绿色荧光强度/蓝色荧光强度）和GP值（generalized polarization；(Fblue-Fgreen/Fblue Fgreen）的计算值可用于评价相态。例如进行外部刺激（药物处理、氧化应激等）、基因操作（目的基因的过表达或敲降）引起的细胞形态结构变化及其相态的分析。此外，作为细胞功能分析的一环，还观察到了细胞类型间的相态比较。
Laurdan：在观察到两种波长的荧光后，从观察图像中计算出荧光比（或GP值），使用拟色进行比率型图像分析。
◆原理
LipiORDER是根据溶剂的分子极性改变荧光特性的溶剂极性响应型荧光色素（Solvatochromic fluorescent dye)（图1）。此外，本试剂对脂质膜具有高亲和性，浓缩在细胞的膜结构中。通过这两个特点，本试剂根据膜内部的极性将荧光由绿色变为红色。相态反映了脂质的包裹密度，稀疏包裹的Ld极性高，而紧密包裹的Lo极性低，通过观察膜结构的极性可定量观察相态（图2上）。实际上，与模型Lo相（sphingomyelin/Cholesterol; SM/Chol）显示绿色荧光（荧光波长最大~510 nm）相对，模型Ld相（dioleylphosphatidylcholine；DOPC）发生长波长偏移，显示红色荧光（荧光波长最大~575 nm）（图2下）。另外，在被认为是SM/Chol与DOPC中间模型的DOPC/Chol中，观察到SM/Chol与DOPC中间的荧光光谱，可通过观察本试剂获得的绿色荧光强度FG（荧光显微镜中的检测波长范围约为500~550 nm）和红色荧光强度FR（检测波长范围约550~650 nm）的荧光强度比FR/FG，相对定量膜相态。
图1. 溶剂的分子极性依赖性荧光响应性
图2. 溶剂的分子极性依赖性荧光响应性
上图：根据相态的荧光特征变化图 下图：模型脂质体中的荧光光谱
◆特点
● 由405 nm激发产生的绿色荧光强度FG（500~550nm）和红色荧光强度FR（550~650nm）的荧光强度比FR/FG和相态之间存在相关性。
● ※ 本试剂几乎不被488 nm激光吸收，可作为激发488 nm以上的光的荧光色素使用。
● 显示出的性质：荧光比FR/FG的值越大，则越接近无序相Ld状态；FR/FG值越小，则越接近有序相Lo状态。
● 极性响应型荧光色素，在低极性环境中发出荧光。在水溶液中不发出荧光，在高S/N比下可观察到膜结构和脂肪滴。
● 只需将本试剂添加至活细胞中，即可摄入至细胞膜、内膜和脂肪滴，并会根据膜的相态表现出不同的荧光特性。
● 拥有脂质体模型、培养细胞和斑马鱼的染色实绩。
● ※ 有关斑马鱼的染色情况，请参考原著论文。
● 已确认本试剂的荧光特性几乎不受蛋白、多糖等的影响。
● 与现有的分子极性响应型荧光色素Laurdan相比，显示更高的光稳定性。
◆原著论文
Valanciunaite et al., Anal. Chem., 92, 6512-6520 (2020) Polarity Mapping of Cells and Embryos by Improved Fluorescent Solvatochromic Pyrene Probe.
◆观察注意事项
生物膜相态是通过荧光比来定量的，所以需要检测在405 nm激发下的两种波长的荧光。同时在Green频道约500-550 nm和Red频道约550-650 nm获得荧光，再使用各种分析软件算出荧光比。为获取荧光比，在每次荧光观察时需注意不能使信号饱和。这种色素在488 nm、560 nm处不吸收，所以可与一般的绿色、红色和近红外荧光发生共染色。建议获取以下溶液的荧光图像作为校准对照：
|
油（Labrafac oil） |
脂肪滴检测标准 |
|
Sphingomielyne/Cholesterol |
Lo标记 |
|
DOPC |
Ld标记 |
◆应用数据
■ 活细胞成像
添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至COS7细胞中，培养10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光图像（激发光：405 nm；荧光Green：470-550 nm，Red：550 nm~）。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行比率测量分析（荧光比FR/FG），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可视化相态。细胞膜的FR/FG低，估计在ER等细胞内膜中FR/FG高。
Heat map的详细分析结果。
将比率测量分析图像的各个热图层抽出，并分析。
■ 观察神经细胞膜的相结构
添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至E17.5小鼠来源的海马原代神经细胞（DIV3或DIV12）中，培养10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光成像（激发光：405 nm、荧光Green：470~550 nm，Red：550 nm~）。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行分析（荧光比FR/FG），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可视化相态。通过比率测量分析，可观察到在所有膜结构中，细胞膜的FR/FG低，与Lo的环境接近；内膜结构的FR/FG高，与Ld的环境接近。
■各个图像的荧光观察图像以及比例分析的应用。
在激光共聚焦显微镜的405 nm激发光下，使用绿色荧光图像（470-550 nm）和红色荧光图像（550 nm以上），并通过ImageJ算出比率测量分析图像。
将比率测量分析图像的疑似色热图阶段性分割，可以看出，FR/FG（接近Lo）的信号，随着荧光比率不断增大（接近Ld），会距离细胞膜越来越远。
■ 观察依赖于细胞外刺激的膜相态变化
用胆固醇去除剂的β-cyclodextrin（β-CD; 15 mM）处理COS7细胞4 h，清洗细胞，并添加LipiORDER（300 nM in HBSS），培养细胞10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光图像（激发光：405nm，荧光Green：470-550nm，Red：550nm~）。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行比率测量分析（荧光比FR/FG），并用拟色（Lo■■■■■■■Ld）可视化相态。通过β-CD处理可观察到细胞结构的显著变化，提取热图的深绿色层（荧光比0.06-0.34）时，发现其分布发生了很大的变化。
※ 上述细胞染色数据，由名古屋市立大学大学院 药学研究科 服部光治教授提供。
■ 光稳定性
比较现有的分子极性检测试剂Laurdan和LipiORDER的光稳定性。与Laurdan表现出显著的光衰减相比，LipiORDER即使在暴露1 h后仍保持稳定。该试剂也可用于长期成像。
※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| FDV-0041 | LipiORDER(Membrane Lipid Order Imaging Dye) LipiORDER（膜脂质序成像染料） |
0.1 mg | – |
| 免责声明 |
|
1. 本公司密切关注本网站发布的内容，但不保证发布内容的准确性、完整性、可靠性和最新性等。 2. 本公司不保证使用本网站期间不会出现故障或计算机病毒污染的风险。 3. 无论何种原因，使用本网站时给用户或第三方造成的任何不利或损害，本公司概不负责。此外，对于用户与其他用户或第三方之间因本网站发生的任何交易、通讯 3. 或纠纷，本公司概不负责。 4. 本网站可提供的所有产品和服务均不得用于人体或动物的临床诊断或治疗，仅可用于科研等非医疗目的。如任何用户将本网站提供的产品和服务用于临床诊断或治 4. 疗，以及其他特定的用途或行为，本公司概不保证其安全性和有效性，并且不负任何相关的法律责任。 |
