gmp级pei操作方法
Jinpan Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)
订购信息
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货号 |
产品名称 |
规格 |
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78EF10003–5Ml 78EF10003-1L |
Jinpan Polyethyleneimine PEI PRO(GMP) |
5Ml 1L |
储存温度：2-4℃保存⼀年。（避免冷冻）
产品描述
Jinpan Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP级别转染试剂，本制品利BIOHUB公司生产的线性阳离子聚合物,按照符合GMP认证管理体系下，采用药用规格原辅料生产，所用起始材料及所需化学品和配制过程均在无菌环境中操作进行，以确保制造过程中每个步骤的特性、效力、纯度和安全性的一致性 。并严格控制重金属残留、细菌内毒素残留等，生产工艺符合 GMP 规范的产品生产与质量管理规程，保障生产过程及所有原辅料可追溯。
操作方法参考
一、贴壁细胞转染 以 6 孔板转染 293T 细胞为例：
（一）转染前准备
1) 转染前一天：用胶原酶 （WORTHINGTONG 公司 LS004196)消 化细胞并计数（不建议用胰酶）。 按照每孔2×10 6的细胞量接种293T至6孔板(每孔加入2ml新鲜DMEM:F12+5%FBS *培养基和 1ml 的细胞悬液)置于 37°C,5%CO2培养箱培24h。
2) 24h 后,移除之前培养基，每孔加入 2ml 新鲜的 DMEM:F12+5%FBS。
注意：确保 293T 细胞生长状态良好传代 不超过15代。
（二）转染过程
3) 第一天：显微镜下检查细胞汇合度，当细胞达到 70%到 80%的汇合度时，开始准备转染。
4) 对于每孔细胞，用 100µl 无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释 DNA 使 DNA 终浓 度为 1ug/ml（DNA/总培养体积）。
5) 对于每孔细胞，用100μ无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释适当比例的适量 Jinpan-PRO GMP 。DNA:Jinpan-PRO GMP 的比例要依据自己实验摸索最适比例。
6) 将稀释的 Jinpan-PRO GMP转染试剂加入到稀释的质粒中（总体积 200µL）轻轻混匀， 室温孵育30分钟。
7) 小心地将 Jinpan-PRO GMP复合物滴加到细胞培养板每个孔中，轻轻摇动培养板混匀。注 意加入混合液时轻轻沿着孔板边缘滴入，而不是在细胞的顶部以免破坏细胞的粘附性。
8) 将培养板放入 37°C，5%CO2培养箱培养中培养 24h。
（三）观察转染结果 9) 第二天：在荧光显微镜下观察细胞转染效率，通常超过 80%的 293T 细胞在转染后的 24h 可以观察到绿色荧光。 小贴士 :建议进行不同基因转染时应对 Jinpan-PRO GMP 和 DNA 的比例进行优化，以达到最适比例， 通常筛选范围在 1:1 到 1:3 之间。如果之前用过进口品牌的 PEI，用Jinpan-PRO GMP时应适当 降低使用浓度。
通常情况下，分别准备Jinpan-PRO GMP 和DNA转染溶液时其体积一般是转染前每孔细胞培 养液体积总量的 1/10-1/20，如细胞培养液体积为 3ml，则稀释Jinpan-PRO GMPI及 DNA 的体积为150ul。质粒 DNA 的浓度通常为 1ug/ml（DNA 质量/细胞培养总体积）[1][4]。 不同质粒种类以及大小会影响转染效率，如较大片段插入质粒可能转染效率低，可根据 实际实验需要调整，如适当增加转染质粒总量等。 ØHEK293 GnTI 细胞重悬浮可用枪头或移液管反复吹打，但 CHO-S 细胞的粘附性比较强 重悬浮时需要借助细胞刮刀。 一般建议用胶原酶消化细胞，如果表达的是膜蛋白，胰酶消化细胞可能会降低蛋白表达， 建议用胶原酶消化细胞，我们推荐(LS004196WORTHINGTONG)的胶原酶。 对于贴壁性低的细胞系，可用明胶或鼠尾胶铺板，增加细胞与培养皿之间的粘附性。 一旦确定了细胞类型、培养基和78BioPEI GMP与 DNA 的最佳比例，就可以在转染后 24 至 96 小时内多次观察转染效率，以优化最大表达量时间点。
二、悬浮细胞转染 离心对数期生长的细胞用新鲜的培养基重悬浮使细胞密度达到 1×10 6cells/mL 小规模转 染时，如需大规模转染细胞密度要到达 2-3×10 6cellsml/mL，可参考文献[4]。以 293F 细胞 于 100mL 培养瓶（溶液体积占瓶体积的 1/5）操作体系举例如下：
（一）转染前准备
1) HEK293F 细胞传代接种于 20mL 悬浮细胞生长培养基中(36.5℃，120rpm，5%CO2 )的条 件下培养。当细胞密度到 1X10 6cells/mL，然后旋紧瓶口放入摇床继续培养，2~4 小时 后可以进行转染。
（二）转染过程
2) 用 1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适量的 DNA，使 DNA 终浓度为 1ug/ml（DNA/总 培养体积）。混匀并静置 5min。
3) 用1mlOptiPRO™SFM(无血清培养基)稀释适当比例的Jinpan-PRO GMP，混匀并静置 10min。
（78BioPEI：DNA 参考比例范围，可参考上述贴壁细胞Jinpan-PRO GMP和 DNA 优化方案优化）。
4) 将Jinpan-PRO GMP转染试剂加入到稀释的质粒中轻轻混匀，室温孵育 30 分钟。
5) 将Jinpan-PRO GMP转染复合物逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床 （36.5℃，5%CO2,120rpm）。
6) 基因表达可在 24-72 小时后检测，具体时间取决于细胞系和转基因.
小贴士
在悬浮培养中，单个细胞的转染效率要高于聚集在一起的细胞，需要优化适合单细胞的 生长条件。 方形瓶应经过两个连续的干燥循环高压灭菌（每个 45 分钟，干燥 15 分钟） 盖子应尽可能松，不得脱落。应该让它们冷却拧紧盖子前，将其*放入层流罩中。如果瓶子向内塌陷，细胞将无法正常生长。 如果要获得更多的蛋白产量，有参考文献表明转染后 24 小时，可以适当稀释细胞，稀释比例参考范围（1:2—1:5）之间，可以增加蛋白产量，稀释效应与最佳稀释比率应根 据经验确定, 可以把 DNA 和Jinpan-PRO GMP 转染试剂直接加入到细胞悬液中进行转染，但必须经过上述 特定流程的 DNA 和转染试剂的比例和用量的相应优化。