用于树突和树突棘浸染的GOLGT-COX染色系统-上海金畔

                            于体外研究

 

    Bioenno Golgi Kit是一种基于高尔基染色法设计出来的试剂盒，用于浸染神经元树突和树突棘（参见下面的参考文献）。该试剂盒在大鼠、小鼠、猫、兔和猴子以及人类死亡后所获得的新鲜脑组织上进行了广泛多次的测试，确定了该试剂盒能将树突和树突棘稳定和高质量的染色（见图A-C）。大多数神经元根据其组织年龄大小，用该试剂盒浸渍需要7-14天（见表2）。试剂盒储存在室温（4-25ºC）下的黑暗区域。

 

图中为用Bioenno Golgi Kit侵染的树突分支和树突棘

（A）：低倍率（4×物镜）显微镜照，显示海马体中高尔基体浸渍的神经元。

（B）：从尾状后肌取出的纹状体神经元。左侧面板框架区域中的树突棘（20×），在右侧图片中放大显示（箭头，63×）。

（C）：从皮质采取的锥体神经元。 中间面板框架区中树突分支上的树突棘（20×）被放大显示在 斜（左，100×）和 主（右，100×）中。 这个阶段常观察到类似丝状伪足的突起（左侧图片的箭头）。

 

参考文献：

• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.

• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.

• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.

• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.

 

保质期：套件中的物品保质期为自购买之日起的12个月之内。

退货政策：Bioenno Tech对此产品的退货政策是自购买之日起90天之内。

 

随套件提供的材料：

•溶液A：浸渍溶液（240 ml×2瓶）。溶液A是工作液，在底部看到沉淀物是正常现象，实验只需使用其上清液。

•试剂B：用于制备两种工作缓冲液。

缓冲液1：浸渍后缓冲液（30 g×5 瓶）制备方法：在90 ml dH₂O中稀释 30g 试剂B

缓冲液2：收集和安装缓冲液（30 g×5 瓶）制备方法：在500 ml dH₂O中稀释30 g试剂B

工作缓冲液可在4ºC下储存长达4周。

 

•溶液C：染色溶液（220 ml×2 瓶）。所提供的溶液C需在使用前用dH₂O（体积比为3：5）稀释。

例如，18ml溶液C + 30ml dH₂O→48ml工作液，试剂盒中提供染色罐可刚好装下所制备的48ml工作液。 48ml工作液可用于多达120个切片（例如，在所提供的染色罐中总共有10个载玻片，每个载玻片黏附有12个鼠脑切片）。

 

•试剂D：复染缓冲液（90 g×2 瓶）。使用前需用dH₂O稀释试剂。

在500 ml dH₂O中稀释90 g试剂D形成工作液。工作液可在室温下储存长达3个月。

48ml工作液可用于多达120个切片（例如，如上所述在染色罐中的12个切片×10个载玻片）。

 

•还包含：

着色笔（大，扁平，1 只），用于切片转移;

圆头笔（小，1 个），用于切片安装;

带盖的染色罐（2个），用于存储，染色和清洗粘连在粘性显微镜载玻片上的切片。

 

套件不提供的必要材料：

蒸馏水或去离子水（dH₂O）;

0.01M PBS-T（见表1）;

塑料或玻璃管和瓶子;

塑料钳;

组织学用品和设备：粘合剂，显微镜载玻片，盖玻片，光学显微镜，震动切片机或微切片机，乙醇，二甲苯或二甲苯替代品，Permount®封片剂。

 

 

0.01 M PBS-T, pH 7.4	1000ml
NaCl   0.1 M PB (pH 7.4)   Triton X-100   加入 dH2O 至   加热搅拌至50~55℃，以增强 Triton X-100的溶解	8.5g   100ml   3ml   1000ml

表1：制备0.01M PBS-T，需先配制0.1M PB（左），然后配制含有0.3％Triton X-100的PBS（右）。

0.1M PB, PH7.4	1000ml
NaH2PO4 •dH2O   NaH2PO4 •7dH2O   加入 dH2O 至   (搅拌使其溶解）	2.62g   21.73g   1000ml

 

 

存储、安全和处理注意事项：

·•将试剂盒存放在室温下。

·•试剂盒中的溶液A和C为含剧毒试剂。 需在通风橱中准备并使用，使用完后收集所有废物。

•  套件A中含有用于危险废物处理的瓶子。

·•在处理试剂盒试剂时，需戴上手套，眼睛和面部有适当的防护以及穿戴合适的防护服，处理后需*清洗双手。

·•处理时避免试剂的吸入和接触皮肤，眼睛。 如接触，立即用水*清洗，必要时寻求医疗援助。

 

 

建议：

·•在处理溶液A和C时使用带盖的玻璃或塑料容器。

·•始终保持容器密闭。不要使用金属工具来承装溶液A。

·•使用溶液A，C或D处理大脑或切片时，避免大脑或切片受光照影响。

·•不要重复使用或稀释工作液，在室温下进行实验以获得宜效果。

 

 

1.浸渍：将刚收获的脑组织浸入溶液A中。溶液A的体积大约是组织块体积的10倍。 例如， 20ml溶液A对应成年大鼠脑（1cm×1cm×2cm）体积。

浸泡1~2天后更换溶液，并在室温下继续避光浸渍（建议浸渍天数见表2）。

意见建议：为了获得宜侵染，建议用生理盐水灌注动物，清除组织中的血液。 麻醉动物（例如用戊巴匕匕妥钠，腹膜内注射100mg / kg）。心脏内或升主动脉用0.9％生理盐水（例如 1000ml dH₂O中含有9g NaCl）灌注至内脏血液量被冲洗掉。灌注通常需要3~5分钟。 解剖大脑并将其谨慎地从头骨上移除。用锋利的刀片切割大脑至1厘米左右的厚度，在0.9％盐水中短暂冲洗，然后浸入溶液A.

 

表2：20-22℃下建议的浸渍总天数（P：出生后一天; 如：P2表示“2天龄”）

动物年龄	尺寸	浸渍时间
P2大鼠	全脑包括头骨无灌注	无灌注，9天
P6大鼠	半球	盐水灌注，7天
P*鼠	半球	盐水灌注，9天
P24大鼠	半球	盐水灌注，10天
P24大鼠	海马块包括皮质	盐水灌注，10天
3-4月大鼠	海马块包括皮质	盐水灌注，11天
P6小鼠	全脑	无灌注，8天   盐水灌注，7天
2-3月小鼠	全脑	盐水灌注，10天
5月小鼠	半球	无灌注，11-12天   盐水灌注，11天

 

组织块的类型和大小的不同可能影响浸渍时间，理想的时间应该通过实验研究获得。在大多数情况下较好的浸渍效果是在2周。如果浸渍超过2周，则可能出现非特异性染色体。

 

2.浸渍后：浸渍准备好后，用蒸馏水或去离子水（dH₂O）冲洗组织块，然后将其转移到套件B所制备的浸渍后缓冲液（30 g稀释在90 ml dH₂O）中，并在室温下避光储存。 在浸泡一天后更新溶液，继续浸泡一天。 在浸渍后2天后，将组织块准备好切片。

 

组织块可以在4°C的缓冲液中储存长达1个月

 

3.切片：可以使用振动切片机或类似类型的切片机将大脑切割成厚度为100-200μm的切片。

切片应收集在套件B所制备的收集和安装缓冲液（30g试剂B，在500ml dH₂O中稀释）中。

建议使用振动切片机或微切片机进行切片。如果切片机刻度范围为1-10，则将速度和振幅设置为4级。 建议在分析树枝状分枝和树突棘时使用100-200μm的厚度。 对于薄切片的切割（例如50μm），需将剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分钟来去除刀片上的油渍。

切片过程可在温度设定在-16°C ~ -20°C的低温恒温器中进行。

 

4.安装：借助所提供的着色笔（大），将切片转移到装有收集和安装缓冲液的填充盘（例如95×15mm培养皿）中。 使用圆头笔（小），将切片安装在粘性显微镜载玻片上。 1个载玻片上可安装6~12个切片。

覆盖切片：用吸水纸（例如滤纸）覆盖湿的切片，然后通过轻压载玻片来给吸水纸压力，以增强切片与载玻片的粘附。

在室温下风干燥切片约1分钟。 长时间暴露在干燥空气中会导致切片破碎。

将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中（已提供）。 放置在封闭的染色罐中的载玻片可以在室温下储存一天。一个染色罐可以存储多达10个载玻片。

 

5.染色：用0.01M PBS-T洗涤载玻片20~30分钟，然后用dH₂O洗涤约1分钟。 将载玻片置于用dH₂O稀释后的溶液C（体积比 3：5）中，在封闭的染色罐中保持20±2分钟（将罐子储存在黑暗区域中），然后将载玻片在dH₂O中漂洗约1分钟。

 

如“试剂盒提供的材料”中所述：溶液C必须在使用前用dH₂O（体积比为3：5）稀释。例如，将18ml溶液C与30ml dH₂O混合，形成48ml工作溶液。试剂盒中提供染色罐可刚好装下所制备的48ml工作液。48ml工作液可用于多达120个切片（例如，在所提供的染色罐中总共10个载玻片，每个载玻片黏附有12个鼠脑切片）。

 

为获得宜效果，请勿重复使用稀释的工作溶液。

为了防止切片滑落，切勿在dH₂O中长时间洗涤。理想的染色时间应由实验研究获得。通常较好的染色效果是在20分钟左右。

 

6.复染色：将载玻片置于试剂D所制备的复染缓冲液中，在暗处中放置20分钟后在0.01M PBS-T中洗涤10分钟×3次。

（可选染剂：在PBS-T洗涤后，切片可用甲酚紫、甲基绿或其他合适的染色试剂复染。）

用dH₂O冲洗载玻片约1分钟，然后风干。当切片不*干燥（通常需要5~10分钟）时，将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中，或继续下一步操作“清洁和覆盖”。

载玻片可以在室温条件下储存在罐中一天。

为了防止长时间暴露在干燥空气导致切片的碎片化，需将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中。

48ml复染缓冲液可用于多达120个切片（例如，如“5.染色”中所述，在染色罐中的12个切片×10个切片）。 为获得宜效果，请勿重复使用工作溶液。

 

7.清洁和覆盖：将载玻片在100％乙醇中脱水约10分钟 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗约10分钟 ×3次。 盖玻片采用的是Permount®封片剂。

将superGolgi–染色用的切片储存在室温和黑暗区域。

用于树突和树突棘浸染的GOLGT-COX染色系统

                            于体外研究

 

    Bioenno Golgi Kit是一种基于高尔基染色法设计出来的试剂盒，用于浸染神经元树突和树突棘（参见下面的参考文献）。该试剂盒在大鼠、小鼠、猫、兔和猴子以及人类死亡后所获得的新鲜脑组织上进行了广泛多次的测试，确定了该试剂盒能将树突和树突棘稳定和高质量的染色（见图A-C）。大多数神经元根据其组织年龄大小，用该试剂盒浸渍需要7-14天（见表2）。试剂盒储存在室温（4-25ºC）下的黑暗区域。

 

图中为用Bioenno Golgi Kit侵染的树突分支和树突棘

（A）：低倍率（4×物镜）显微镜照，显示海马体中高尔基体浸渍的神经元。

（B）：从尾状后肌取出的纹状体神经元。左侧面板框架区域中的树突棘（20×），在右侧图片中放大显示（箭头，63×）。

（C）：从皮质采取的锥体神经元。 中间面板框架区中树突分支上的树突棘（20×）被放大显示在 斜（左，100×）和 主（右，100×）中。 这个阶段常观察到类似丝状伪足的突起（左侧图片的箭头）。

 

参考文献：

• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.

• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.

• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.

• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.

 

保质期：套件中的物品保质期为自购买之日起的12个月之内。

退货政策：Bioenno Tech对此产品的退货政策是自购买之日起90天之内。

免费技术支持：

 

 

 

随套件提供的材料：

•溶液A：浸渍溶液（240 ml×2瓶）。溶液A是工作液，在底部看到沉淀物是正常现象，实验只需使用其上清液。

•试剂B：用于制备两种工作缓冲液。

缓冲液1：浸渍后缓冲液（30 g×5 瓶）制备方法：在90 ml dH₂O中稀释 30g 试剂B

缓冲液2：收集和安装缓冲液（30 g×5 瓶）制备方法：在500 ml dH₂O中稀释30 g试剂B

工作缓冲液可在4ºC下储存长达4周。

 

•溶液C：染色溶液（220 ml×2 瓶）。所提供的溶液C需在使用前用dH₂O（体积比为3：5）稀释。

例如，18ml溶液C + 30ml dH₂O→48ml工作液，试剂盒中提供染色罐可刚好装下所制备的48ml工作液。 48ml工作液可用于多达120个切片（例如，在所提供的染色罐中总共有10个载玻片，每个载玻片黏附有12个鼠脑切片）。

 

•试剂D：复染缓冲液（90 g×2 瓶）。使用前需用dH₂O稀释试剂。

在500 ml dH₂O中稀释90 g试剂D形成工作液。工作液可在室温下储存长达3个月。

48ml工作液可用于多达120个切片（例如，如上所述在染色罐中的12个切片×10个载玻片）。

 

•还包含：

着色笔（大，扁平，1 只），用于切片转移;

圆头笔（小，1 个），用于切片安装;

带盖的染色罐（2个），用于存储，染色和清洗粘连在粘性显微镜载玻片上的切片。

 

套件不提供的必要材料：

蒸馏水或去离子水（dH₂O）;

0.01M PBS-T（见表1）;

塑料或玻璃管和瓶子;

塑料钳;

组织学用品和设备：粘合剂，显微镜载玻片，盖玻片，光学显微镜，震动切片机或微切片机，乙醇，二甲苯或二甲苯替代品，Permount®封片剂。

 

 

0.01 M PBS-T, pH 7.4	1000ml
NaCl   0.1 M PB (pH 7.4)   Triton X-100   加入 dH2O 至   加热搅拌至50~55℃，以增强 Triton X-100的溶解	8.5g   100ml   3ml   1000ml

表1：制备0.01M PBS-T，需先配制0.1M PB（左），然后配制含有0.3％Triton X-100的PBS（右）。

0.1M PB, PH7.4	1000ml
NaH2PO4 •dH2O   NaH2PO4 •7dH2O   加入 dH2O 至   (搅拌使其溶解）	2.62g   21.73g   1000ml

 

 

存储、安全和处理注意事项：

·•将试剂盒存放在室温下。

·•试剂盒中的溶液A和C为含剧毒试剂。 需在通风橱中准备并使用，使用完后收集所有废物。

•  套件A中含有用于危险废物处理的瓶子。

·•在处理试剂盒试剂时，需戴上手套，眼睛和面部有适当的防护以及穿戴合适的防护服，处理后需*清洗双手。

·•处理时避免试剂的吸入和接触皮肤，眼睛。 如接触，立即用水*清洗，必要时寻求医疗援助。

 

 

建议：

·•在处理溶液A和C时使用带盖的玻璃或塑料容器。

·•始终保持容器密闭。不要使用金属工具来承装溶液A。

·•使用溶液A，C或D处理大脑或切片时，避免大脑或切片受光照影响。

·•不要重复使用或稀释工作液，在室温下进行实验以获得宜效果。

 

 

1.浸渍：将刚收获的脑组织浸入溶液A中。溶液A的体积大约是组织块体积的10倍。 例如， 20ml溶液A对应成年大鼠脑（1cm×1cm×2cm）体积。

浸泡1~2天后更换溶液，并在室温下继续避光浸渍（建议浸渍天数见表2）。

意见建议：为了获得宜侵染，建议用生理盐水灌注动物，清除组织中的血液。 麻醉动物（例如用戊巴匕匕妥钠，腹膜内注射100mg / kg）。心脏内或升主动脉用0.9％生理盐水（例如 1000ml dH₂O中含有9g NaCl）灌注至内脏血液量被冲洗掉。灌注通常需要3~5分钟。 解剖大脑并将其谨慎地从头骨上移除。用锋利的刀片切割大脑至1厘米左右的厚度，在0.9％盐水中短暂冲洗，然后浸入溶液A.

 

表2：20-22℃下建议的浸渍总天数（P：出生后一天; 如：P2表示“2天龄”）

动物年龄	尺寸	浸渍时间
P2大鼠	全脑包括头骨无灌注	无灌注，9天
P6大鼠	半球	盐水灌注，7天
P*鼠	半球	盐水灌注，9天
P24大鼠	半球	盐水灌注，10天
P24大鼠	海马块包括皮质	盐水灌注，10天
3-4月大鼠	海马块包括皮质	盐水灌注，11天
P6小鼠	全脑	无灌注，8天   盐水灌注，7天
2-3月小鼠	全脑	盐水灌注，10天
5月小鼠	半球	无灌注，11-12天   盐水灌注，11天

 

组织块的类型和大小的不同可能影响浸渍时间，理想的时间应该通过实验研究获得。在大多数情况下较好的浸渍效果是在2周。如果浸渍超过2周，则可能出现非特异性染色体。

 

2.浸渍后：浸渍准备好后，用蒸馏水或去离子水（dH₂O）冲洗组织块，然后将其转移到套件B所制备的浸渍后缓冲液（30 g稀释在90 ml dH₂O）中，并在室温下避光储存。 在浸泡一天后更新溶液，继续浸泡一天。 在浸渍后2天后，将组织块准备好切片。

 

组织块可以在4°C的缓冲液中储存长达1个月

 

3.切片：可以使用振动切片机或类似类型的切片机将大脑切割成厚度为100-200μm的切片。

切片应收集在套件B所制备的收集和安装缓冲液（30g试剂B，在500ml dH₂O中稀释）中。

建议使用振动切片机或微切片机进行切片。如果切片机刻度范围为1-10，则将速度和振幅设置为4级。 建议在分析树枝状分枝和树突棘时使用100-200μm的厚度。 对于薄切片的切割（例如50μm），需将剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分钟来去除刀片上的油渍。

切片过程可在温度设定在-16°C ~ -20°C的低温恒温器中进行。

 

4.安装：借助所提供的着色笔（大），将切片转移到装有收集和安装缓冲液的填充盘（例如95×15mm培养皿）中。 使用圆头笔（小），将切片安装在粘性显微镜载玻片上。 1个载玻片上可安装6~12个切片。

覆盖切片：用吸水纸（例如滤纸）覆盖湿的切片，然后通过轻压载玻片来给吸水纸压力，以增强切片与载玻片的粘附。

在室温下风干燥切片约1分钟。 长时间暴露在干燥空气中会导致切片破碎。

将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中（已提供）。 放置在封闭的染色罐中的载玻片可以在室温下储存一天。一个染色罐可以存储多达10个载玻片。

 

5.染色：用0.01M PBS-T洗涤载玻片20~30分钟，然后用dH₂O洗涤约1分钟。 将载玻片置于用dH₂O稀释后的溶液C（体积比 3：5）中，在封闭的染色罐中保持20±2分钟（将罐子储存在黑暗区域中），然后将载玻片在dH₂O中漂洗约1分钟。

 

如“试剂盒提供的材料”中所述：溶液C必须在使用前用dH₂O（体积比为3：5）稀释。例如，将18ml溶液C与30ml dH₂O混合，形成48ml工作溶液。试剂盒中提供染色罐可刚好装下所制备的48ml工作液。48ml工作液可用于多达120个切片（例如，在所提供的染色罐中总共10个载玻片，每个载玻片黏附有12个鼠脑切片）。

 

为获得宜效果，请勿重复使用稀释的工作溶液。

为了防止切片滑落，切勿在dH₂O中长时间洗涤。理想的染色时间应由实验研究获得。通常较好的染色效果是在20分钟左右。

 

6.复染色：将载玻片置于试剂D所制备的复染缓冲液中，在暗处中放置20分钟后在0.01M PBS-T中洗涤10分钟×3次。

（可选染剂：在PBS-T洗涤后，切片可用甲酚紫、甲基绿或其他合适的染色试剂复染。）

用dH₂O冲洗载玻片约1分钟，然后风干。当切片不*干燥（通常需要5~10分钟）时，将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中，或继续下一步操作“清洁和覆盖”。

载玻片可以在室温条件下储存在罐中一天。

为了防止长时间暴露在干燥空气导致切片的碎片化，需将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中。

48ml复染缓冲液可用于多达120个切片（例如，如“5.染色”中所述，在染色罐中的12个切片×10个切片）。 为获得宜效果，请勿重复使用工作溶液。

 

7.清洁和覆盖：将载玻片在100％乙醇中脱水约10分钟 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗约10分钟 ×3次。 盖玻片采用的是Permount®封片剂。

将superGolgi–染色用的切片储存在室温和黑暗区域。

 

I. 概述

高尔基染色法是研究正常或异常状态下神经元及胶质细胞的zui有效的技术^{2, 5}，利用高尔基染色技术可以检测到药物处理的动物脑切片或神经系统疾病死亡患者脑切片上神经树突/树突棘的细微改变^{1, 3}。然而常规高尔基染色技术的可重复性及过程费时极大的阻碍了该技术的广泛应用。根据Ramón-Moliner⁵， Glaser 与 Van der Loos⁴发表的研究方法及原理，本公司开发出了FD快速高尔基染色试剂盒（FD Rapid GolgiStain? kit）。该试剂盒不仅极大的改进和简化了常规高尔基染色法，而且在神经元和胶质细胞的形态细节（特别是树突棘）的检测上更为可靠和灵敏。本试剂盒有效性已在多种动物脑片及人类尸检脑片上得到详细验证。(部分图片如下，登录：www.fdneurotech。。ｃｏｍ 可查询更多样品图片及应用本试剂盒的参考文献)。

 

 

 

II. 试剂盒内容物（室温保存）

                          型号

PK401A      PK401

溶液A             125 ml        250 ml

溶液B             125 ml        250 ml

溶液C            125 ml x 2     250 ml x 2

溶液D             125 ml        250 ml

溶液E             125 ml        250 ml

玻璃取片器          2            2

毛刷                2            2

滴瓶                1            1

塑料夹              1            1

说明书              1            1

III. 需自备材料及试剂

1. 双蒸水或Milli-Q水

2. 塑料/玻璃瓶或管，

3. 病理染色设备，明胶包被的载玻璃片 (Cat. #PO101)，盖玻片，染色缸，乙醇，二甲苯，封片剂，显微镜

 

IV. 操作注意事项

1. 本试剂盒仅仅用于体外研究，不得用于药物、诊断等其它用途。

2. 本试剂盒内试剂皮肤接触时为有毒有害，误服有致命危险，取用时用电动移液器或洗耳球吸取（不得用嘴吸取），并避免吸入或接触皮肤、眼睛。如有接触需立即用大量水冲洗并及时就医。加入误服，应吐出并用大量水漱口，并立即就医。

3. 在通风橱内操作，穿戴防护服，手套，护眼眼睛。每次实验结束后*清洗手部。

 

V. 组织准备

一、实验准备：（使用本试剂盒前请仔细阅读该部分）

所有容器（为塑料材质）须洗净并用双蒸水冲洗。

在操作溶液A及溶液B是避免使用金属容器。

使用过程中保持容器密闭。

使用溶液A与溶液B进行处理（包括处理切片）时尽量保持避光。?

二、操作步骤：（以下步骤除明确要求外均在室温下进行）

1. 实验动物须深度麻醉后处死，脑组织（或人尸体脑组织）应尽快并小心取出，避免损伤或压迫组织。

注意：除必要的情况下动物无需灌注，如确实需要以4%多聚甲醛灌注动物，应少于5分钟，并不用后固定。

大的脑组织（包括大鼠脑）应以锋利小刀切割成约10mm厚的小块（重要）。

2. 双蒸水或Milli-Q 水冲洗组织以除去表面血液。

3. 将组织浸入等体积的溶液A和溶液B混合而成的浸泡液中，室温避光保存约2周，在浸入6小时或第二天更换浸泡溶液。通常2周的浸泡时间可以获得满意的实验结果，但是不同大小及类型的组织需要的浸泡时间可能不同，因此，为获得*的实验结果，每种类型的组织在相同大小下仍需要预实验以确定*浸泡时间，一般而言3周的浸泡时间对大多数组织均足够。需要注意的是，浸泡时间越长，背景染色越深。

注意事项：浸泡液需要在使用前24小时配置，并保持静止，使用无沉淀的上清作为浸泡液。配置好的浸泡液可以在室温下避光保存一个月。每一立方厘米至少使用5 ml浸泡液，浸泡液过少可减少染色敏感性及可靠性。同时，为获得*染色效果，每周应轻柔旋转摇动浸有组织块的容器两次（切忌剧烈摇动），每次几秒即可。

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i 警告:

溶液A及溶液B因含有有毒的氯化银，重铬酸钾及铬酸钾，避免接触皮肤，误服可能致死。实验应在化学通风橱或安全柜里进行，并穿戴适当的保护服，手套及眼/脸保护设备。用完的溶液不得倒入下水道，应装入的容器内，通知有害试剂回收部门进行处理。

4. 将浸泡后的组织转入溶液C，室温避光保存72小时（zui多一周）。浸泡24小时后换液一次。

5. 在冰冻切片机上调整切片箱温度（-20°C 到 -22°C）将组织片切成100到200 μm 切片（切片前请仔细阅读本条下的注意事项）。除冰冻切片机外，其它如滑动式切片机或振动切片机等也可以使用（细节请看本条下注意事项）。然后用本试剂盒提供玻璃取片器将切片转移至滴有溶液C的明胶包被载波片上(Cat. #PO101) ，为便于在载波片上滴加溶液C，本试剂盒提供了一只滴瓶。载波片上多余的溶液应以巴斯德管吸除，然后用吸水纸尽可能吸净，或者可导致脱片。然后将切片自然风干（切忌热风吹干或烤干）。为尽可能获得好的染色结果，切片应尽快进行染色，如确需保存，可在室温避光条件下保存zui多3天。

注意事项：

（1）、切片准备：为避免组织冰冻是受到损坏，尽可能好的保持组织细胞形态，样品应在冰冻切片机上进心速冻。例如：样品可以如下方式进行速冻：将样品放在塑料勺中，缓慢浸入以干冰预冷的异戊烷（为获得*结果，预冷的异戊烷应低于零下70度，在1分钟内浸入，越慢越好），在组织*浸入异戊烷后，等待几秒然后捞至干冰上放置一分钟，以确保样品达到*速冻状态。在切片前切忌速冻好的样品解冻。

（2）切片机选择：能切出较厚切片的切片机均可选择（如100um）。如冰冻切片机只有一个温度控制，请在切片前设置切片箱温度至-22度至少4小时。如切片机有两个温度设置程序，请设置切片箱温度低于刀头温度1度。需要注意的是，-22度多数情况下可以获得满意的染色结果，然而不同的切片机与不同样品可能需要高一些或低一些的切片温度以保证切片的平滑与完整。

（3）以下内容有助于冰冻切片机操作：1）使用双蒸水将样品装到样品盘上，并确保样品未融化（可以在干冰上操作）。也可以用其它样品凝固剂进行安装（如OCT）但是不要将样品*包在凝固剂上，避免切片时刀片切到凝固剂。如果样品必须包埋后才能切片，请使用TFM（TBS, Durham, NC, USA, Cat. #TFM-5）包埋。2）样品装上样品盘后，干冰上放置10分钟，然后立即将装上样品的样品盘安装到冰冻切片机上相应位置，在切片前任其放置5分钟。3）先试切几片（勿使用防卷板），如样品过冷（可能表现为与刀片平行的切片易碎），那么请等待几分钟再切，如切片符合要求，则可继续切片。

? 灌注的脑组织也可以用琼脂糖或白明胶包埋，然后用振动切片机进行切片，但是必须使用溶液C收集切片（切片机孵育槽里须注满溶液C）。否则切片在干燥时可能碎裂。如用滑动切片机切灌注的脑组织，刀台和刀片均需要维持在低温（低于零度），同样，切片必须覆盖在溶液C内。

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VI. 染色步骤：

1.双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。

2. 将切片放入混有1份溶液D，一份溶液E及两份双蒸水或Milli-Q水的混合液中处理 10分钟。

如：溶液D10ml+溶液E10 ml+双蒸水或Milli-Q水20 ml

注意事项：混合工作液须现用现配，100ml混合工作液zui多处理100张小鼠脑片（根据切片大小确定）。染缸必须加盖以避免试剂蒸发，并不时旋转搅动孵育液。在整个染色过程中（封片前）均勿让切片啊干燥。

3. 双蒸水或Milli-Q水清洗切片两次，每次4分钟。(每次更换双蒸水).

 

4. 甲酚紫或硫堇衬染（可选步骤），如要进行衬染，步骤3中清洗时间和次数均要增加，如清洗4次，每次5分钟或更长时间。

 

5. 50%、75%、95% 乙醇梯度脱水, 每个梯度4分钟 (不可跳过某个浓度).

6. 无水乙醇脱水4次，每次4分钟（不可增加时间）

7. 二甲苯透明3次，每次4分钟，用Permount?封片。

注意事项：封片前切片可在二甲苯中存放几小时，为获得*染色效果，请使用纯的未稀释的Permount?封片。染色好的切片应随时避光。

 

VII. 已发表的使用本试剂盒的文章

1. Robinson TE, Kolb B (1997) Persistent structural modification in nucleus accum-bens and prefrontal cortex neurons produced by previous experience with ampheta-mine. J. Neurosci. 17:8491-8497.

2. Corsi P (1987) Camillo Golgi’s morphological approach to neuroanatomy. In Masland RL, Portera-Sanchez A and Toffano G (eds.), Neuroplasticity: a new therapeutic tool in the CNS pathology. pp 1-7. Berlin: Springer.

3. Graveland GA, Williams RS, DiFiglia M (1985) Evidence for degenerative and regenerative changes in neostriatal spiny neurons in Huntington’s disease. Science 227:770-773.

4. Glaser ME, Van der Loos H (1981) Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain. J. Neurosci. Methods 4:117-125.

5. Ramón-Moliner E (1970) The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH

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订货信息:

货号	品名	CAS	价格￥	规格	品牌
PK401	FD Rapid GolgiStain Kit		10368		fdneurotech
PK401A	FD Rapid GolgiStain Kit (small)		7152		fdneurotech
PK401-C	FD Rapid GolgiStain Kit, solution C, 250 ml		3190		fdneurotech