内胚层监测试剂盒

ES/iPS Differentiation Monitoring Kit–Human Endoderm

　　本品使用 ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法检测培养上清中的 Marker 蛋白质，因此可以在不损坏细胞的情况下，继续培养细胞并监测其分化状态。另外，本品可用于多检体测定，因此认为可用于分化诱导剂等药物筛选。

◆特点：

　●　特异性检测ES/iPS细胞分化内胚层

　●　在不损坏细胞的情况下，继续培养细胞并监测其分化状态

　●　可短时间检测多检体

◆试剂盒组成：

　　胚胎干细胞或多能性干细胞经由三胚层（内胚层、中胚层、外胚层）可分化所有细胞，因此在实现再生医疗方面备受瞩目。三胚层中内胚层细胞是分化成人类重要机能器官如胰脏、肝脏的细胞，为了确保处于正确的分歧点，有效率的细胞分化诱导和分化度的确认是必不可少的。我们通过测定 mRNA 或细胞内蛋白质的表达量确认细胞分化程度。为了能判断上述物质的表达量，需破坏一部分的培养细胞。

　　本品通过检测培养上清中的 Marker 蛋白质，可检测ES/iPS细胞到内胚层细胞的分化程度。这些 Marker 蛋白与内胚层 Marker Sox17、Foxa2 双阳性细胞率相关。

图1. 人iPS细胞分化为内胚层的培养上清中 Marker 蛋白每天的量及内胚层比例（Sox17，Foxa2 双阳性细胞）的关系。

A）培养上清中 Marker 蛋白每天的分化量

B） 内胚层细胞每天分化的比例

【参考文献】

[1]: H. Iwashita, N. Shiraki, D. Sakano, T. Ikegami, M. Shiga, K. Kume, S. Kume, PloS ONE., 2013, 8(5): e64291.

人ES/iPS细胞检测试剂盒

可检测未分化细胞数

◆特点

　●　通过对培养上清的分析，监测未分化细胞数的增减。

　●　因其测定对象为培养上清，不会在检查过程中消耗细胞数量，且可在此过程中继续进行细胞培养

　●　少量的培养上清（50 μL）即可分析

　●　采用ELISA测定法，可简单快速的处理多样品

　试剂盒构成

◆原理

　●标准曲线制作

　　该试剂盒中未含有绘制标准曲线用的标准品。因此，请按照下述顺序调制标准品后，再行绘制标准曲线：

　　　1.　在未分化维持培养条件下进行人ES/ iPS细胞培养，更换培养基的第二天（18至24小时后）回收培养上清。

　　　2.　细胞剥离，测定人S/ iPS细胞数。

　　　3.　计算出回收到的培养上清中所含的人ES/ iPS细胞数。如：培养基量 5 mL，测定细胞数为 5×10⁶ cells 时，则回收培养上清中的

　　　　　人ES/ iPS细胞数即为 1×10⁶ cells/mL。

　　　4.　利用回收的培养上清未分化维持用培养基或已分化培养基，制成已知细胞浓度的稀释系列，以绘制标准曲线。

◆分化诱导时的使用案例

　　　1.　在未分化维持培养时，对人ES/iPS细胞的培养上清进行取样，计算人ES/iPS细胞数。

　　　2.　在分化用培养基中对第１项的培养上清进行稀释，制成稀释系列，以绘制该试剂盒的标准曲线。

　　　3.　使用本试剂盒测定可确认人ES/iPS细胞数的培养上清。

　　　4.　推算分化条件下残存的人ES/iPS细胞数

【细胞株间和培养基间的比较】

　　在各个未分化维持用培养基（培养基A、B、C、D）中分别培养人类iPS细胞201B7株和253G4，更换培养基后第二天回收培养上清。计算细胞数量，用各个未分化维持用培养基将各培养上清稀释至2,000cells/mL，进而测定该试剂盒的吸光度。测定结果如下图所示。结果表明，即使细胞株或培养基等培养条件的细胞数量恒定，信号强度也有差异。因此，必须为培养条件绘制标准曲线。

【人类iPS细胞培养上清的测定】

　　用 StemSure^® hPSC 培养基培养人类iPS细胞201B7株，更换培养基第二天回收该培养基的培养上清。于此同时，计算细胞数量，阶段性的在 StemSure^® hPSC 培养基中稀释培养上清，并将稀释后的培养上清用试剂盒检测。结果可得到一个极高相关系数的线性公式。根据这个线性公式求出该培养条件下的人类iPS细胞检测下限值^※为108 cells/mL。

※检测下限值：根据培养基背景吸光度平均值+3.3SD和线性公式计算出来的细胞数量。

【分化细胞培养上清和人类iPS细胞培养上清液混合检测】

　　将含有成纤维细胞和人膝关节软骨（NHAC-kn）细胞的血清培养基上清与人类iPS细胞培养上清混合后，确认能否测定添加在其中的未分化细胞标志物。将iPS细胞混合比例0~20%（0～2×10⁴ cells/mL：总细胞数 1×10⁵ cells/mL）的人iPS细胞培养上清，混合到成纤维细胞和人膝关节软骨细胞培养上清中，用试剂盒检测。在血清和成纤维细胞存在的条件下，可在培养上清中测定出人iPS细胞培养上清。

　　另外还可从成纤维细胞/人膝关节软骨细胞和iPS细胞的混合试验材料中得出一个线性公式，根据该公式可求出人iPS细胞的检测下限值^※，分别为：170 cells/mL 和 96 cells/mL。

　使用注意项

　　●　由于细胞株、培养基种类等培养条件的不同，会导致信号轻度和细胞数的关系产生差异，所以必须绘制细胞株、未分化维持培养条

　　　  件、分化诱导培养基标准曲线。

　　●　不同培养条件下，不能依靠信号强弱来评定未分化性。未分化性的评定一定要在相同培养条件下进行。

　　●　用该试剂盒测算出来的ES/iPS细胞数与实际细胞数未必一致。对未分化维持状态和进行细胞分化的监控，也是需要参考的指标之一。

欲了解更多相关资料请点击文字：无损监测具有致瘤性人ES/iPS细胞的技术

◆相关产品

●荧光标识rBC2LCN
　　添加到人类ES/iPS细胞培养液中，可为人类ES/iPS活细胞染色。

●rBC2LCN-PE23
　　仅加入含有人类ES/ iPS细胞的培养液中，可以选择性地杀死人类ES/ iPS细胞。

●rBC2LCN汽提溶液
　　可将与人类ES/ iPS细胞表面糖链聚合起来的rBC2LCN从细胞上剥落下来。rBC2LCN剥落后，细胞还可添加其他抗体进行染色、培养。

●BC2LCN凝聚素, 重组体、溶液
　　集中未标识的rBC2LCN

●StemSure^® hPSC培养基Δ
　　无饲养层细胞条件下可用于维持培养人类ES/iPS细胞的无血清液态培养基。原料不含动物体成分。

●StemSure^®系列
　　通过小鼠ES细胞D3株或人类iPS细胞201B7株，进行品质测验。

●Y-27632, MF
　　该品作为培养基添加物被登记在原药等登录原簿（MF）中。以自主规格为基础，实现原料管理、制造工程和分析实验的有效检验，创建可以恒常稳定产品品质的体制。＜点击此处＞

●ES・iPS细胞研究用试剂
　　2007年iPS细胞确立发表后，许多与iPS细胞相关的文献纷纷发表。在各种各样的文献中报道出来的与ES细胞・iPS细胞的未分化功能维持和分化诱导相关的低分子化合物也逐渐阵容化。＜点击此处＞

●液态培养基・细胞培养用试剂
　　我们有着以液态培养基为首的平衡盐溶液、细胞剥离·分散液、抗生物质溶液、细胞外基质等丰富的产品种类。＜点击此处＞

Q：　培养上清中会有糖萼蛋白残留吗？

A：　糖萼蛋白会被释放到培养上清中。培养上清在37℃条件下保存８天，信号都不会减弱，因此作为本试剂盒测试对象的糖萼蛋白上的糖链

         在此期间都能保持其稳定性。如果冷冻保存的情况下，糖链安定性可稳定维持４个月。（但切记避免反复冻融。）

Q：　糖萼蛋白可作为标准品使用吗？

A：　该试剂盒是用于检测糖萼上的糖链的。因合成附有糖链的蛋白质很困难，所以生产出试剂盒适用的标准品也不易。虽然可能可以制作出不

         带糖链的糖萼蛋白，但是否能够作为标准品就不得而知了。

Q：　释放的足糖萼蛋白长度是恒定的吗？

A：　足糖萼蛋白是氨基酸配列恒定的，分子量为 55 kDa 的蛋白质，但实际上足糖萼蛋白上还附有Ｏ型糖链、N型糖链和葡糖胺聚糖，分子量

         为240 kDa 以上的大型粘蛋白分子。因是由糖链修饰程度和性质不同的分子群混合起来的异质糖蛋白质群，分子量并不是恒定的。

         电泳分子量＞240kDa。

Q：　在三维细胞培养中，足糖萼蛋白也能释放出来吗？

A：　是的，三维培养中也能释放足糖萼蛋白。

Q：　足糖萼蛋白的作用是什么？

A：　足糖萼蛋白在人类iPS细胞中的机能暂时未知，但和未分化细胞的形态、增值性、分化能等有着密切的关系。它是发现肾脏肾小球足细胞的

         主要糖蛋白，在足细胞形态的形成和足细胞机能中起重作用。足糖萼蛋白缺失的小鼠，会引起肾脏异常致死。

Q：　回收培养上清时，是否需要进行混匀？

A：　是的。摇晃孔盘/孔板轻轻混匀后，再进行培养上清的回收。

Q：　阳性对照品和阴性对照品的使用目的是什么？

A：　用以确认试剂盒反应系是否正常进行。

Tateno, H., Onuma, Y., Ito, Y., Hiemori, K., Aiki, Y., Shimizu, M., Higuchi, K., Fukuda, M., Warashina, M., Honda, S., Asashima, M. and Hirabayashi, J.: Sci. Rep., 4, 4069 (2014).

ES细胞・iPS细胞培养用血清代替品

StemSure^® Serum Replacement

　　本产品是ES细胞和iPS细胞培养中使用的血清代替品。血清含有分化诱导因子，会导致干细胞分化。使用本产品代替血清，可在ES和iPS细胞培养的同时，保持他们的未分化状态，达到稳定培养。
　　本产品不含剧毒物质，将其作为普通物质处理。
　　使用本产品配制培养基培养的小鼠ES细胞，可用于制备嵌合体小鼠，并确认其种系传递。

◆特点•优势

●　可用于嵌合体小鼠制备，并确认其种系传递。

●　作为血清替代品，用于小鼠ES细胞・人IPS细胞培养。

●　不含剧毒物质。

◆案例•应用

1、嵌合体小鼠的制备与种系传递Update！！

　　将组装 HaloTag^® cDNA 的目标载体导入小鼠ES细胞，用含有 StemSure^® Serum Replacement（SSR）的培养基培养。确认载体导入小鼠ES细胞后，将其注入至 ICR 小鼠的胚盘胞，并移植至 ICR 小鼠的子宫。得到的嵌合体小鼠与 C57BL/6J 小鼠交配，获得F1小鼠。

(1) 　嵌合体小鼠

　　收集嵌合体小鼠的血液，用 TRITC（四甲基若丹明异硫氰酸盐）对 HaloTag^® 蛋白质染色。发现小鼠ES细胞源的 HaloTag^® 的血液被染色，可确认为嵌合化。

(2)　F1小鼠

　　F1小鼠的血液发现 HaloTag^® 存在，可确认用 SSR 培养基培养的ES细胞嵌合小鼠能够正常存活。

2、人iPS细胞201B7的培养

(1)　克隆形态与ALP染色 

　　已确认可用 StemSure^® Serum Replacement（SSR）培养人iPS细胞 201B7 株。ALP 染色呈阳性。

　　<培养基组成>
　　D-MEM/Ham's F-12 + 20% SSR + 2 mmol/L L-Glutamine +1×MEM Non-essential Amino Acids + 0.1 mmol/L StemSure^® 2-Mercaptoethanol + 1×Penicillin-Streptomycin + 5 ng/mL bFGF

(2)　未分化标记的发现

　　使用 StemSure^® Serum Replacement（SSR）培养的人iPS细胞201B7株，确认各种未分化标记（Sox2, Oct3/4, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-81）呈阳性。

3、小鼠ES细胞D3的培养

(1)　细胞形态与ALP染色

　　使用 StemSure^® Serum Replacement（SSR）培养小鼠ES细胞D3，能观察到小鼠ES细胞群特有的光泽，ALP染色呈阳性。

(2)　细胞增殖曲线

　　用不同培养基培养小鼠ES细胞D3进行14继代培养，比较细胞增殖。

　　如下图所示StemSure^® 系列与Ａ公司有同等的性能。

　　< StemSure^® 系列培养基组成>
　　StemSure^® D-MEM + 15% SSR + 2 mmol/L L-Glutamine + 1×MEM Non-essentialAmino Acids + 0.1 mmol/L StemSure^® 2-Mercaptoethanol + 1×Penicillin-Streptomycin + 1,000 units/mL StemSure^® LIF

　　（使用胶原包被的12孔板）

(3)　细胞群倍加数*

　　使用不同培养基对小鼠ES细胞D3进行继代培养，检查培养天数与细胞群倍加数的关系。

　　下图显示 StemSure^® 系列与Ａ公司产品的细胞群倍加数相同。

　　*细胞群倍加数 cell population doubling level，缩写PDL，指从培养开始至现在细胞群的倍增次数。

<培养基组成>

　　StemSure^® D-MEM + 15% SSR + 2 mmol/l L-Glutamine + 1×MEM Non-essentialAmino Acids + 0.1 mmol/l StemSure^® 2-Mercaptoethanol + 1×Penicillin-Streptomycin + 1,000 units/ml StemSure^® LIF

　　（使用胶原包被的12孔板）

(4)　未分化标记的检测

　　使用 StemSure^® 系列对小鼠ES细胞D3进行５代继代培养，各种未分化标记（Nanog, Oct3/4, Sox2, SSEA-1）呈阳性。

　　<培养基组成>
　　StemSure^® D-MEM + 15% SSR + 2 mmol/L L-Glutamine + 1×MEM Non-essential Amino Acids + 0.1 mmol/L StemSure^® 2-Mercaptoethanol+ 1×Penicillin-Streptomycin + 1,000 units/mL StemSure^® LIF

4、畸形瘤的形成

　　用 StemSure^® 系列对小鼠ES细胞D3进行继代培养。对免疫不全小鼠的皮下注射培养后细胞。在形成皮下畸形瘤，其内部检测出神经组织（外胚叶源）、软骨组织（中胚叶源）、管腔结构纤毛上皮（内胚叶源）。

　　<培养基组成 >
　　StemSure^® D-MEM + 15% SSR + 2 mmol/L L-Glutamine + 1×MEM Non-essential Amino Acids + 0.1 mmol/L StemSure^® 2-Mercaptoethanol+ 1×Penicillin-Streptomycin + 1,000 units/mL StemSure^® LIF

ES细胞・iPS细胞培养用血清代替品

★StemSure^® 系列★

　　StemSure^® 系列可培养ES细胞和iPS細胞。使用小鼠ES细胞D3检测每批产品的品质。

　　●　StemSure^® D-MEM・巯基乙醇，硫代甘油

　　●　StemSure^® 明胶溶液

　　●　StemSure^® LIF, 小鼠, 重组. 溶液,

　　●　StemSure^® 冻存溶液

已有案例引用的培养基配方

iPSC培养基组成如下：含15％StemSure  Serum Replacement（197-16775; Wako Pure Chemical Industries） DMEM /  F12，1％抗生素 – 抗真菌混合溶液，1％非必需氨基酸（139-15651; Wako Pure Chemical Industries ），2mM谷氨酸（16948-004; Nacalai Tesque）和0.1mMβ-巯基乙醇（21438-82; Nacalai Tesque）。文献全文请点击参考文献页面。