Abbexa  abx151519说明书

人成纤维细胞生长因子19(FGF19)ELISA试剂盒

 目录号：abx151519

尺寸：96T

范围：15.6 pg/mL-1000 pg/mL

灵敏度：< 5.7 pg/mL

储存：96孔板、标准品和检测试剂在-20 ℃下储存，试剂盒的其余部分在4 ℃下储存。

应用：定量检测人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液等生物体液中的FGF19。

检测原理：本试剂盒基于夹心酶联免疫吸附试验技术。将抗体预包被在96孔板上。向孔中加入标准品、供试品和生物素结合试剂并孵育。然后加入HRP结合试剂，并孵育整个平板。在每个阶段使用洗涤缓冲液除去未结合的结合物。TMB底物用于定量HRP酶促反应。加入TMB底物后，只有含有足量FGF19的孔才会产生蓝色产物，然后加入酸性终止液后变为黄色。黄色强度与平板上结合的FGF19量成正比。采用分光光度法在酶标仪中测定450 nm处的光密度(OD)，据此计算FGF19的浓度。

试剂盒组分

• 预包被96孔微孔板：12 x 8

• 标准品：2管

• 标准稀释缓冲液：20 mL

• 冲洗缓冲液：(30X)20 mL

• 检测试剂A：(100X)120 μL

• 检测试剂B：(100X)120 μL

• 稀释剂A：12 mL

• 稀释剂B：12 mL

• TMB底物：9 mL

• 终止液：6 mL

• 封板机：4

需要但未提供的材料

• 37 °C培养箱

• 多通道和单通道移液器和无菌移液器吸头

• 喷射瓶或自动微孔板洗板机

• 1.5 mL试管

• 蒸馏水

• 吸水性滤纸

• 100 mL和1 l量筒

• 0.01 mol/L PBS(pH 7.0-7.2)

• 酶标仪（波长：450 nm）

• ELISA振荡器

方案

A. 样品制备

立即分析或在2-8 ℃下储存样品（24 h内）。对于长期储存，等分并储存在-20 ℃或-80 ℃下。避免多次冻融循环。

血清：应将样本采集至血清分离管中。将试管垂直放置在4 ℃下过夜或在室温下静置1 h，凝固血清。以约1000×g离心20分钟。如果出现沉淀，再次离心。立即测定或等分并储存在-20 ℃或-80 ℃下。

血浆：使用EDTA或肝素作为抗凝剂采集血浆。采集后30分钟内，以1000 xg离心15分钟。如果出现沉淀，再次离心。避免使用溶血样本。

组织匀浆：组织匀浆的制备因组织类型而异-这只是一个例子。用冰冷PBS冲洗组织，以除去过量血液。均质化前称重。将组织切碎，在冰上用组织匀浆器在PBS中匀浆化，并对细胞悬液进行超声处理。以5000×g离心匀浆5分钟，收集上清液。

细胞裂解液：用胰蛋白酶分离贴壁细胞，离心收集，除去上清液。在冰冷PBS中清洗细胞3次，并在PBS中重悬细胞。超声裂解细胞4次，或-20 ℃冷冻，解冻至室温3次。在2-8 ℃下以1500×g离心10分钟，除去细胞碎片。收集上清液。

细胞培养上清液：以约1000×g离心20分钟，除去沉淀。

其他生物液体：以约1000×g离心20分钟，除去沉淀。立即分析或分装并储存在-20 ℃或-80 ℃下。

备注：

必须稀释样本，使预期浓度在试剂盒范围内。用0.01 mol/L PBS(PH = 7.0-7.2)稀释样品。

始终使用无热原、无内毒素的采血管采集血液。

建议使用新鲜样本或近期获得的样本，以防止可能导致错误结果的蛋白质降解和变性。

NaN3不能用作供试品防腐剂，因为它抑制HRP。

如果手册申请中未指明样本，则需要进行初步实验以确定试剂盒的适用性。

B. 试剂制备

标准品溶液：用1.0 mL标准稀释缓冲液制备标准品溶液，制备4000 pg/mL标准品溶液。将复溶的标准品静置10分钟，轻轻搅拌，然后进行系列稀释。避免产生泡沫或气泡。进一步稀释4倍得到高浓度标准品1000 pg/mL。在用于系列稀释的试管上贴上标签-参见下图以供参考。向各试管中等分0.5 mL标准品稀释剂缓冲液（高浓度标准品试管除外）。向第1支试管中加入0.5 mL高浓度标准品溶液，充分混匀。从第1个试管转移0.5 mL至第2个试管，充分混匀，以此类推。

注：复溶期间不得涡旋标准品，因为这会使蛋白质不稳定。标准品复溶后，应在15分钟内使用。不建议重复使用复溶的标准品。

清洗缓冲液：用蒸馏水将浓缩清洗缓冲液稀释30倍(1/30)（即，将20 mL浓缩清洗缓冲液加入580 mL蒸馏水中）。如果在浓缩清洗缓冲液中形成晶体，则加热至室温并轻轻混合，直至晶体*溶解。

检测试剂A工作溶液制备：实验前制备不超过15分钟。

1. 计算所需工作溶液的总体积。

2. 用稀释剂A将检测试剂A稀释100倍，充分混匀。移液器动作缓慢、平稳，可减少体积误差。

检测试剂B工作溶液制备：在实验前制备不超过15分钟。

1. 计算所需工作溶液的总体积。

2. 用稀释剂B将检测试剂B稀释100倍，充分混匀。移液器动作缓慢、平稳，可减少体积误差。

C. 试验方案

按照上文所述制备所有标准品、样品和试剂。使用前，将试剂盒组分和样本平衡至室温。建议重复测量两次，并绘制每个试验的标准曲线。

• 在预包被板上分别设置标准孔、供试品孔和对照（零）孔，记录其位置。在不接触侧壁的情况下，将溶液添加到每个孔的底部。在加入到孔中之前，将标准品和样品上下吸移混匀。避免产生泡沫或气泡。

2. 将100 μL稀释标准品等分至标准品孔中。

3. 将100 μL标准稀释缓冲液等分至对照（零）孔中。

4. 将100 μL适当稀释的样品等分至供试品孔中。轻敲微孔板混匀，或使用微孔板振荡器。

5. 用封板覆膜覆盖微孔板，并在37 ℃下孵育1 h。

6. 取下盖子，弃去液体。请勿清洗。

7. 向各孔中分装100µl检测试剂A工作溶液。用封板覆膜覆盖微孔板，并在37 ℃下孵育1 h。

• 取下盖子，弃去溶液。用清洗缓冲液清洗微孔板3次。使用多通道移液器或自动清洗器，用清洗缓冲液(300 μL)*填充每个孔（建议浸泡1-2分钟）。每个步骤*去除液体对于良好性能至关重要。终清洗后，通过抽吸或倾析除去任何剩余的清洗缓冲液。倒置微孔板，在干净的吸水纸巾上吸干。

9. 向各孔中分装100µl检测试剂B工作溶液。密封平板，并在37 ℃下孵育30分钟。

10. 取下盖子，弃去溶液，重复步骤8中描述的清洗过程5次。

• 向各孔中分装90 μL TMB底物。用封板覆膜覆盖微孔板。轻轻敲击微孔板使其充分混合。在37 ℃下孵育10 min。孵育时间仅供参考，终用户应确定宜时间。避免暴露于光照下。

12. 向各孔中分装50µl终止液。重要的是，在整个微孔板中快速均匀地混合终止液，以*灭活酶。

13. 确保平板底部没有指纹或水，孔中的液体无气泡。立即测量450 nm处的OD。

计算时，取各参比标准品和各样品的OD 450读数的平均值，然后减去平均对照（零）OD读数。

（相对OD）=（每个孔的OD）-（零孔的OD）

以各参比标准品溶液(X)的相对OD对各标准品溶液(Y)的相应浓度绘制标准曲线。可根据标准曲线内插样品浓度。如果测定的样品被稀释，则将内插得到的浓度乘以稀释因子，得到稀释前的浓度。

注意事项：

使用试剂盒前，离心试管，使盖中的内容物减少。

在两次孵育之间，请勿长时间暴露微孔。每个步骤的试剂添加时间不得超过10分钟。

在孵育步骤期间，确保平板正确密封或覆盖，并且时间和温度受控。

请勿重复使用移液器枪头和试管。

请勿使用过期组件或来自不同套件的组件。

TMB底物应在无菌条件下使用，并尽量减少光暴露。未使用的底物应为无色或浅黄色。请勿将任何残留溶液丢弃回小瓶中。

请注意，该试剂盒经过优化，可用于检测天然样本，而不是重组蛋白或合成化学品。我们无法保证重组蛋白的检测，因为它们可能与天然蛋白具有不同的序列或三级结构。

精密度：

试验内精密度（试验内精密度）：3份含低、中和高水平FGF19的样本分别在一个平板上检测20次。

试验间精密度（试验间精密度）：在3个不同平板上检测低、中和高水平FGF19的3份样本，每个平板8份重复样本。

CV(%)=（标准偏差/平均值）×100批内：CV < 10%

批间：CV < 12%

D. 典型数据和标准曲线

提供的典型标准曲线数据仅用于演示目的。必须为进行的每次分析生成新的标准曲线。