Haematologic Technologies，Inc。（HTI/haemtech）是一家ISO 9001：2015注册公司，是一家专业从事体外研究用高质量血浆蛋白分离和表征的主要制造商。HTI的重点是凝血级联中涉及的蛋白质，以及骨代谢的调节。HTI产品系列包括超过150种高度纯化和充分表征的蛋白质，包括酶原，酶，辅因子和抑制剂，以及单克隆和多克隆抗体的互补系列。还可提供因子缺乏的等离子体和定制的血液采集管，用于临床研究。提供的服务包括定制蛋白质纯化，蛋白质修饰，化验开发，合同制造和合同研究。

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Coagulation Factor Va

凝血因子Va

说明了因子Va在凝血酶原
酶组装中的参与和凝血酶原酶复合物的表达。由重（VaH）和轻（VaL）链组成的因子Va与带负电荷的磷脂膜结合并有效地用作膜结合因子Xa（Xa）的受体。酶复合物用于将酶原凝血酶原（II）转化为活性丝氨酸蛋白酶凝血酶（IIa），在蛋白水解事件中除去凝血酶原的片段1.2（F1.2）部分。

HCVA-0110 Human Factor Va

BCVA-1110 Bovine Factor Va

因子Va是丝氨酸蛋白酶因子Xa的辅因子，并且在钙离子存在下，它们共同组装在磷脂表面上以形成凝血酶原酶复合物（1）。凝血酶原酶复合物负责凝血酶原快速转化为凝血酶。因子Va由α-凝血酶在有限的蛋白水解作用下衍生自促辅因子，因子V. 因子V的凝血酶裂解从分子的中心部分释放出两个重度糖基化的活化肽，其没有辅因子功能。因子Va由NH2-末端衍生的重链（Mr = 94,000）和COOH-末端衍生的轻链（Mr = 74,000）组成，其在钙离子存在下保持缔合。辅因子结合磷脂（细胞膜）表面并有效地充当膜结合因子Xa的受体。凝血酶原酶复合物（因子Xa，因子Va，磷脂和钙）的*组装导致凝血酶原转化率相对于单独因子Xa观察到的速率增加300,000倍。因子Va和因子Xa之间的相互作用由因子Va的重链和轻链介导，而凝血酶原与因子Va的结合仅由重链介导。

通过用凝血酶活化纯化的因子V来制备因子Va，随后通过免疫亲和层析（2）纯化。该过程产生不含活化肽和凝血酶的辅因子制剂。纯化因子Va以50％甘油（体积/体积），5.0mM CaCl 2提供，并应储存在-20℃。通过SDS-PAGE分析测定纯度，并在因子Va凝固测定中测量活性。

参考

出版物

• Monteiro，R.，et al。，Biochem。J.（2005）387,871-877。（凝血酶原激活）
• Reis，C.，et al。，Biochem。J.（2006）398,295-302（凝血酶原激活）

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Coagulation Factor V

凝血因子V.

通过α-凝血酶
活化因子V表示α-凝血酶对单链因子V（330,000）的活化。箭头表示凝血酶切割因子V的位点，除了形成Va的重链（94,000）和轻链（74,000）外，还产生两个活化肽（71,000和120,000）。因子Va的重链和轻链仍然存在在钙离子存在下非共价结合。

HCV-0100 Human Factor V

BCV-1100 Bovine Factor V

因子V是一种大的单链血浆糖蛋白，它是血液凝固级联中的必需成分（1）。在凝血过程中，通过丝氨酸蛋白酶α-凝血酶的有限蛋白水解（如上所述），将因子V的因子V转化为活性辅因子因子，并且因子Xa的效率较低。活性辅因子由NH2-末端衍生的重链（Mr = 94,000）和COOH-末端衍生的轻链（Mr = 74,000）组成，其在钙离子存在下保持非共价结合。因子Va用作丝氨酸蛋白酶因子Xa的辅因子。因子Va和Xa以非共价和钙离子依赖性方式在磷脂表面上组装，以形成凝血酶原酶复合物。凝血酶原酶复合物负责将酶原凝血酶原快速转化为活性丝氨酸蛋白酶α-凝血酶。凝血酶原酶复合物的组装相对于单独的因子Xa的速率，凝血酶原转化为凝血酶的速率提高了近300,000倍。通过活化蛋白C使因子Va失活，部分地实现了凝血酶原酶复合物的下调。

如Katzmann及其同事所述，使用免疫亲和层析从新鲜冷冻的人血浆制备人因子V.（2）。使用Nesheim及其同事描述的常规色谱技术从新鲜牛血浆制备牛因子V.（3）。纯化因子V以50％甘油（体积/体积）提供，应储存在-20℃。通过SDS-PAGE分析测定纯度，并在因子V凝固测定中测量活性。

参考

• Mann，KG，et al。，Ann。Rev.Biochem。，57,915（1988）。
• Katzmann，JA，et al。，Proc。国家科。科学院。科学。美国，78,162（1981）。
• Nesheim，ME，et al。，J.Biol。Chem。，254,508（1979）。
• Tracy，PB等，Blood，60,59（1982）。
• Nesheim，ME等人，Methods Enzymol。，80,249（1981）。
• Jenny，RJ，et al。，Proc。国家科。科学院。科学。美国，84,4846（1987）

出版物

• Ofosu，F.，et al。，Biochem。J.（1992）283,893-897。（因子V激活）
• Ainle，F.，et al。，Blood。2009 114：1658-1665（抑制因子V激活）
• Weeterings，C.，et al。，Blood 2008 112：3227-3233（凝血酶代）
• Yang，X。等，Biochem。J.（1990）272,399-406（因子V的激活）

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Haematologic HCBT-0022说明书

凝血酶（β，γ）

蛋白水解形式的α-凝血酶
上文说明了人α-凝血酶向较低活性形式的降解模式。通过在Arg106-Tyr107键处切割完整的B链产生β-凝血酶，产生B1和B2片段。通过在Lys190-Gly191键处进一步切割β-凝血酶B2链产生γ-凝血酶，产生B4和B5片段。尽管未示出，但B3片段是通过在Lys190-Gly191键处切割完整B链而衍生的潜在中间体，产生通常称为β'-凝血酶的产物。（此处使用的氨基酸编号始于A链的NH2末端并继续通过B链）。

 HCBT-0022 人体β凝血酶

 HCGT-0021 人类γ凝血酶

α-凝血酶是通过酶原凝血酶原的蛋白水解活化产生的高度特异性丝氨酸蛋白酶（1）。已经显示纯化形式的α-凝血酶（2-4）在长期储存时经历自溶作用至较低活性形式。在用胰蛋白酶（5）有限消化α-凝血酶时观察到类似的失活。这些蛋白水解形式的α-凝血酶被称为β-凝血酶和γ-凝血酶。通过在Arg106-Tyr107键处切割B链产生人β-凝血酶。通过在Lys190-Gly191键处进一步切割β-凝血酶B2链产生γ-凝血酶。通过在Arg-154处单个裂解凝血酶形成另一种形式的蛋白水解凝血酶，称为β'-凝血酶。γ-凝血酶通过B链中这两个位点（Arg70 / 73和Arg-154）的蛋白水解切割产生。这些切割导致不再共价连接到凝血酶分子上的肽的释放，但通过离子交换和凝胶过滤色谱保持相关。这些蛋白水解形式的凝血酶保留了切割小合成底物（6,7）和一些蛋白质底物如因子XIII（8），抗凝血酶III（9）和凝血酶原（10）的能力。它们凝固纤维蛋白原（11），裂解血小板反应蛋白（12）或激活蛋白C（9）的能力已显着降低。

通过TPCK处理的胰蛋白酶的有限蛋白水解，基本上通过Braun等人的方法，由纯化的α-凝血酶制备人β-凝血酶和γ-凝血酶。（5）。蛋白水解形式的α-凝血酶在100mM NaH 2 PO 4，pH 6.5缓冲液中提供，应储存在-20℃。通过SDS-PAGE评估纯度，并使用纤维蛋白原凝固测定评估活性。

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haemtech HCT-0020说明书

Thrombin (alpha)

凝血酶（alpha）

凝血酶原
的蛋白水解活化丝氨酸蛋白酶α-凝血酶通过酶原激活凝血酶原而产生。酶复合物凝血酶原酶催化凝血酶原中两个肽键的蛋白水解，产生NH2末端衍生的F1.2区和异二聚体α-凝血酶。α-凝血酶由“A”链（Mr = 6000）组成，其通过单个二硫键与“B”链（Mr = 31,000）共价连接。

 HCT-0020 人类α-凝血酶

  |

 HCT-DFP 人类α-凝血酶，

 HCT-FPRCK 人类α-凝血酶，PPACK（FPRck）活性位点被阻止

 HCT-BFPRCK 人α-凝血酶，生物素化PPACK（FPRck）活性位点阻断

 BCT-1020 牛α-凝血酶

 BCT-DFP 牛α-Thrombin，

 BCT-FPRCK 牛α-凝血酶，PPACK（FPRck）活性位点被阻止

 BCT-BFPRCK 牛α-凝血酶，生物素化PPACK（FPRck）活性位点封闭

 MCT-5020 小鼠α-凝血酶

α-凝血酶是通过酶原凝血酶原的蛋白水解活化产生的高度特异性丝氨酸蛋白酶（1）。在凝血期间，凝血酶裂解纤维蛋白原以形成纤维蛋白，导致凝血的终步骤，形成纤维蛋白凝块。凝血酶还负责反应激活因子V因子和因子VIII。据报道，凝血酶还激活因子XIII和血小板，并且还起血管收缩蛋白的作用。凝血酶的促凝血活性以两种方式停止：1）通过肝素辅助因子II或抗凝血酶III /肝素复合物抑制; 或2）与血栓调节蛋白形成复合物。凝血酶/血栓调节蛋白复合物的形成导致凝血酶不能切割纤维蛋白原并激活因子V和VIII，

凝血酶是由NH2-末端“A”链（Mr = 6,000）和COOH-末端“B”链（Mr = 31,000）组成的双链酶，其通过单个二硫键保持共价结合。人凝血酶比牛凝血酶短13个氨基酸，这是由于人蛋白上的凝血酶切割位点不存在于牛蛋白中。

凝血酶还用于细菌中表达的融合蛋白的位点特异性切割（9-11）。凝血酶敏感位点掺入目的重组蛋白和促进纯化和/或表达的肽或蛋白质之间。通过用凝血酶切割，从表达的杂交体释放靶蛋白。然后可以通过亲和层析容易地除去凝血酶。

使用如Nesheim等人所述的Lundblad程序（1）的修改，由纯化的凝血酶原制备人，牛和小鼠凝血酶。（2）。凝血酶以50％（vol / vol）甘油/ H2O供应，应储存在-20oC。通过SDS-PAGE分析确定纯度，并在凝血酶特异性凝固测定中测量活性，并与标准化的NIH凝血酶进行比较。凝血酶也可用活性位点用DFP，FPRck或生物素化的FPRck阻断。

融合蛋白的切割
除了在凝血研究中的广泛应用外，凝血酶还可用于融合蛋白的位点特异性切割。凝血酶敏感位点掺入目的重组蛋白和促进纯化和/或表达的肽或蛋白质之间。通过用凝血酶切割，从表达的杂交体释放靶蛋白。然后可以通过亲和层析容易地除去凝血酶。批次一致性确保每次都可重现的结果。对于涉及细胞培养的实验，请与我们联系，讨论用于细胞培养的定制低内毒素批次。

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