PhyNexus 蛋白质A PhyTip列 说明书

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PhyNexus在一直是行业的*,一直为广大科研客户提供zui为的产品和服务,上海金畔一直秉承为中国科研客户带来的产品，的服务，为了给广大科研客户带来更加完善的产品和服务,您的满意将是我们zui大的收获

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Douglas Gjerde于2002年在加利福尼亚州的圣何塞市建立了PhyNexus公司，以调查蛋白质样品制备的需求。专栏和机器人被开发小型化和自动化过程，当保留蛋白质的自然状态时。2005年，引进了一整列的专栏和机器人。在接下来的几年中，柱子被修改为与所有主要的机器人液体处理器兼容。定期提供超过20种色谱柱的化学品，提供超过100种定制包装的产品。从2016年开始，引入了试剂盒和仪器，大大增加了瞬时转染质粒的可用性。PhyNexus客户是制药公司和学术界的生命科学家。

 

PhyNexus开发了一种*的微型工程蛋白质和抗体纯化技术，使研究人员能够定期纯化和富集样品量达1 mL。PhyTip™色谱柱的*设计允许低至10μL的洗脱体积，从而产生高达50倍的富集因子，纯化蛋白浓度可达5 mg / ml。

纯化和富集过程是一个简单的三步技术，首先捕获感兴趣的蛋白质，然后纯化并zui终富集。整个过程可能需要不到15分钟，以产生高浓度的全功能蛋白质，以备进一步分析。

蛋白A PhyTip柱显示功能性抗体（IgG）的高结合亲和力和高容量亲和力纯化。

  • 70-90％的IgG回收率
  • 获得高度浓缩的纯化蛋白质
  • 显示蛋白A PhyTip柱可以从不同水平的背景蛋白中提取非常高纯度的IgG蛋白

 

 

 

 

 

 

 

 

蛋白质A PhyTip列

具有蛋白A的PhyTip色谱柱已针对特定的PhyNexus试剂和仪器流速/体积进行了优化，如下所示。这些信息是使用PhyNexus纯化系统收集的。所有含蛋白A的PhyTip色谱柱均配有推荐的PhyTip缓冲液，包括：捕获缓冲液 – 适用于需要添加额外缓冲液以补充样品体积并确保捕获正确pH的情况。清洗缓冲液I – 磷酸盐缓冲液pH 7.4清洗缓冲液II – 盐水溶液。注意：无缓冲能力以确保有效洗脱富集缓冲液 – 用于zui终洗脱步骤 – 磷酸盐缓冲液pH 2.5中和缓冲液。 – Tris缓冲液pH9.0注意：浓缩缓冲液以4mL的pH2.5磷酸盐缓冲液提供，

含蛋白A树脂的200多个PhyTip色谱柱：

对于含有1mg BSA的5μgIgG2a（抗FITC MAb。）的200μL样品，使用下述条件进行处理，在zui终样品体积中回收大于40％的原始IgG质量。另外，通过用考马斯（Coomassie）检测的SDS-PAGE测定，回收的IgG超过95％纯。

捕获：通过以250μL/分钟的流速通过树脂床4个循环捕获200μL样品。

纯化：将200μL的PhyNexus蛋白A洗涤缓冲液I以500μL/ min的流速通过树脂床两个循环，接着用洗涤缓冲液II再次洗涤，在树脂床上流过两个循环速率500μL/ min。

富集：用10μLPhyNexus A蛋白富集缓冲液将蛋白质洗脱至溶液中，以500μL/ min的流速通过树脂床5个循环。用3μLPhyNexus蛋白A中和缓冲液中和。

所运送的蛋白G富集缓冲液包含：111mM NaH 2 PO 4，14.8mM H 3 PO 4中的140mM NaCl，pH 3.0

含蛋白A树脂的1000+ PhyTip色谱柱：

对于含有5mg BSA的10μgIgG2a（抗-FITC MAb。）的500μL样品，使用下述条件进行处理，在zui终样品体积中回收大于40％的原始IgG质量。另外，通过用考马斯（Coomassie）检测的SDS-PAGE测定，回收的IgG超过95％纯。

捕获：以250μL/分钟的流速通过树脂床捕获500μL样品四个循环。

纯化：将1000μL的PhyNexus蛋白G洗涤缓冲液I以500μL/ min的流速通过树脂床两个循环，接着用洗涤缓冲液II再次洗涤，以流速500通过树脂床两个循环μL/分钟。

富集：用15mL PhyNexus蛋白A富集缓冲液将蛋白洗脱到溶液中，以500μL/ min的流速通过树脂床5个循环。用5μLPhyNexus蛋白A中和缓冲液中和。

 

蛋白APhyTip®色谱柱的性能特征和分析步骤

介绍

PhyNexusPhyTip®色谱柱是创新性的纯化工具，从根本上简化了各种来源的蛋白质的捕获，纯化和富集。这些净化工具成功的关键是设计保留亲和树脂床的机制，具有zui小的死体积和zui大的捕获潜能。一组PhyTipcolumn结合蛋白A在特定的*条件下特异性结合来自不同来源的抗体（IgG），因此可以去除核酸和其他污染物。快速洗涤步骤后，纯化的抗体很容易用常用的低pH缓冲液洗脱。该技术允许特异性的高产量的IgG，取决于各种条件，并且提供在非常高浓度的载体蛋白如BSA存在下的高度选择性纯化。PhyTip色谱柱具有*的结合能力，可以结合大于100μg的IgG，并且可以有效地回收少至200 ng的IgG – 代表几乎三个数量级的范围。PhyTip色谱柱非常适合从杂交瘤上清液进行抗体筛选，或用于高通量提取和纯化亲和标记蛋白质。

绩效和分析程序

IgG以高亲和力和特异性结合蛋白A. 这种相互作用的强度和选择性使蛋白质A能够有效地从复杂的蛋白质混合物中纯化出IgG。为了检查用蛋白A树脂的PhyTip柱的性能，测量了使用1000个蛋白A PhyTip柱的纯化IgG（抗FITC-MAb）的回收百分比。

材料和方法

样品：在0.5ml 
含有5mg BSA的PBS中的10μgmFITC-MAb（IgG2a亚类）或
2.含有10％FBS（胎牛血清）的DMEM或
3.含有5mg BSA的SFM（无血清培养基）
样品处理：使用以下方案在半自动ME 1000平台上处理所有样品：

  1. （1）捕获：通过使样品在树脂床上以2个输入/输出循环（以0.6ml @ 0.25ml / min的体积设定）捕获特定蛋白质。
  2. （2）纯化：通过用0.5mL PBS（洗涤缓冲液I）洗涤结合的蛋白质/亲和树脂，使用1进/出循环（体积设定为0.6ml，0.5ml / min）除去未结合的蛋白质，随后是1进/出循环（体积程序为0.6ml，0.5ml / min）和0.5ml盐水溶液（洗涤缓冲液II）。
  3. （3）富集：用15μLpH 3.0洗脱缓冲液以4次输入/输出循环洗脱IgG2a（体积程序为0.1-0.15ml @ 1ml / min）。一旦洗脱，加入5μL中和缓冲液。请注意，PhyNexus提供的蛋白A和蛋白G PhyTip色谱柱的当前洗脱缓冲液的pH值为2.5，目前的中和缓冲液的pH值为9.0。

定量程序

（1）为了制备还原的IgG2a，将15μlzui终洗脱体积与5μl新鲜制备的TCEP（15μl10mg / ml TCEP的水溶液，终体积30μl）反应。

（2）使用HP 1050HPLC系统将20μl还原的IgG2a注射到无孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶剂A（0.1％TFA的水溶液）和溶剂B（0.1％TFA的ACN溶液）之间的梯度为25％至75％，使用5分钟。检测：在214和280nm处的UV。

  1. （3）大约3.18和3.34分钟时洗脱主要的IgG2a峰。在这两个峰下面的区域在每种情况下从（3.13-3.5）分钟积分，相应的峰面积在214nm处记录。
  2. （4）在相同的反应条件下将TCEP处理的IgG2a标准物加载到柱子中并用作回收计算的输入或标准。

IgG2a恢复的结果

在DMEM + 10％FBS中的回收率=在SFM + 5mg BSA中的77％回收率= 64％。

已知载体蛋白如白蛋白诱导免疫应答并有助于产生良好的抗体，所以当抗体产生时其通常以高量存在。因此，任何纯化和富集程序必须能够耐受高浓度的白蛋白。另外，上面显示的结果似乎表明高背景蛋白质浓度（例如BSA）的存在可能对回收率具有有益的影响。

载体蛋白存在下IgG2a回收率的重现性

为了验证载体蛋白在zui大IgG2a回收率中的作用，并证实重现性，从多个样品（n = 4）中从PBS（以及含有5mg BSA的PBS）纯化IgG2a。结果表明在存在500倍过量的BSA浓度的情况下提高了纯化的IgG2a的恢复（至少20％或更多），并且该程序也是高度可重现的。

在PBS中回收= 42.25％（SD = 4.66％）在PBS中回收+ 5mg BSA = 66.5％（SD = 7.5％）

选择性性能和分析程序

为了表征和验证蛋白A-IgG亲和相互作用的选择性，将5mg BSA作为载体蛋白加入到0.5ml样品体积（333倍过量）中的15μgIgG中。使用蛋白A PhyTip柱处理样品。

材料和方法

样品：在含有5mg BSA（10mg / ml或1％w / v BSA）的0.5ml PBS或PBS中的15μgmFITC-MAb（IgG2a亚类）。样品处理：如上所述的恢复性能和分析程序。

IgG定量和纯度分析程序：

（1）将15μlzui终洗脱体积分成两部分：13μl与新制备的13μl10mg / ml TCEP（终体积=26μl，[TCEP] = 17.5mM）在室温下反应约16小时，同时在每个实验中将2μl加载到凝胶上。

（2）使用HP 1050HPLC系统，将26μl以上的减少的IgG2a中的20μl注入到无孔聚苯乙烯二乙烯基苯反相（C-18）柱中。溶剂A（0.1％TFA的水溶液）和溶剂B（0.1％TFA的ACN溶液）之间的梯度为25％至75％，使用5分钟。检测：在214和280nm处的UV。

  1. （3）在3.17和3.3分钟左右洗脱两个主要的IgG2a峰。这两个峰下的面积在每种情况下从（3.13-3.5）分钟积分，相应的mAU在214nm记录。
  2. （4）在相同的反应条件下，将TCEP处理的IgG2a标准物（注入量为1.08,2.16,4.32,6.48和8.64μg的FI TC-M Ab）加载到柱中并用作恢复计算的标准曲线。

PhyNexus建议使用含有IgG的PhyTip入门试剂盒作为标准来验证PhyTip色谱柱在所有应用中的使用。

纯化和富集的样品必须清晰，无颗粒物质。强烈建议离心样品，并使用PhyTip色谱柱前仅使用清澈的上清液。

运输和存储

每包PhyTip色谱柱已经制造并按照zui高标准进行了质量控制，并运送到保持盒中，以保持每个PhyTip色谱柱内特定亲和树脂的完整性。本产品在环境温度下运输，但收到时应存放在标准的实验室冰箱中，温度在4℃到8℃之间。

  • 不要冻结或冻结。
  • 不使用时，请将箱子的盖子关好并密封好，存放在冰箱内。
  • 不要让亲和树脂在干燥的环境中长时间存放干燥。

当从PhyNexus运输时，含有蛋白A的PhyTip色谱柱储存在甘油中。

 

相关产品如下：

RESIN ROBOTIC SYSTEM TIP VOLUME QTY/BOX RESIN VOLUME PART NUMBER DESCRIPTION
Protein A Tecan Freedom Evo MCA 96-well 200 96 5 PTM 92-05-01 Box of 96 PhyTip columns (200 µL volume) 5 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo MCA 96-well 200 96 20 PTM 92-20-01 Box of 96 PhyTip columns (200 µL volume) 20 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo MCA 96-well 500 96 20 PTM 95-20-01 Box of 96 PhyTip columns (500 µL volume) 20 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo MCA 96-well 500 96 40 PTM 95-40-01 Box of 96 PhyTip columns (500 µL volume) 40 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo MCA 96-well 500 96 80 PTM 95-80-01 Box of 96 PhyTip columns (500 µL volume) 80 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo MCA 96-well 500 96 160 PTM 95-16-01 Box of 96 PhyTip columns (500 µL volume) 160 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo LiHa & Tecan Te-MO 1000 96 10 PTT 91-10-01 Box of 96 PhyTip columns (1 mL volume) 10 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo LiHa & Tecan Te-MO 1000 96 20 PTT 91-20-01 Box of 96 PhyTip columns (1 mL volume) 20 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo LiHa & Tecan Te-MO 1000 96 40 PTT 91-40-01 Box of 96 PhyTip columns (1 mL volume) 40 µL of Protein A affinity resin per column
Protein A Tecan Freedom Evo LiHa & Tecan Te-MO 1000 96 80 PTT 91-80-01 Box of 96 PhyTip columns (1 mL volume) 80 µL of Protein A affinity resin per column