agilent 210518说明书

agilent 210518即Stratagene 210518

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit

Instruction Manual Catalog # 210518 (10 reactions) and #210519 (30 reactions) Revision F.0

uikchange闪电现场定向诱变试剂盒

Quikchange闪电现场定向诱变试剂盒
提供的材料

Quikchange Lightning Site定向诱变试剂盒（目录210518）含有足够的试剂，总共10种。
反应，包括2个控制反应。
b Quikchange Lightning Site定向诱变试剂盒（目录210519）含有足够30种试剂。
反应，包括2个控制反应。
c将dntp混合物解冻一次，制备一次性小份，并将小份储存在-20°C下。不要对dntp混合物进行处理。
多次冻融循环。d dntp混合物和dpn i酶的成分是专有的。这些试剂已针对
quikchange-lightning协议，并已获得与其他套件组件一起使用的资格。不
用其他安捷伦试剂盒或其他来源的dntp混合物或dpn i酶制剂替代。
E基因型：tetr
∆（mcra）183∆（mcrcb hsdsmr mrr）173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac hte
【F’Proab Laci】
Q
Z∆M15 tn10（太特
Amy Camr
]
f见介质和试剂的制备。
储存条件
XL10金超能干细胞、XL10金β-Me和PUC18控制质粒：–80°C
所有其他部件：–20°C
所需附加材料
14毫升bd falcon聚丙烯圆底管（bd biosciences目录）
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal）
异丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG）

买方通知
本产品的使用是根据以下美国专有技术号57891665932419中的一个或多个获得许可的，
6391548、6713285、7132265和7176004。
本产品是根据Bio-Rad实验室和安捷伦技术公司之间的协议提供的。
本产品的制造、使用、销售或进口均以我方为准。拍打。编号6627424和EP
拍打。Bio-Rad Laboratories，Inc.所有的1 283 875 B1号。购买本产品后将
买方不可转让使用购买的产品和部件的权利。
研究领域的PCR产品（但不是实时PCR），包括所有应用研究领域
（包括但不限于动物试验和食品试验）。

 

介绍
Quikchange Lightning站点定向诱变套件*提供突变
质粒比我们原来的QuikChange试剂盒快三倍
诱变效率或准确性的损失。该套件已针对
高达14kb质粒的诱变，允许快速、和
用单一试剂盒诱变大小质粒。使用
先进的高保真酶技术，协议
加速，同时保持高的现场指导精度
诱变。QuikChange Lightning网站
诱变试剂盒是一种专有技术的基于pfu的聚合酶混合物。
优化的dpn i酶，它们一起允许在
大约一个小时，加上一夜之间的转变。

图1 Quikchange闪电现场定向诱变方法概述。

美国专有技术号7176004；7132265；6734293；6444428；6391548；6183997；
5948663、5932419和5789166。
六
体外定向诱变是一种非常有价值的技术
描述蛋白质结构之间的动态、复杂关系
和功能，用于研究基因表达元件，以及执行
矢量修改。这种技术的几种方法
但这些方法通常需要单链DNA
（SSDNA）作为模板1–4
劳动密集型或技术难度大。
我们的QuikChange Lightning站点定向诱变套件允许站点特定
几乎所有双链质粒的突变，从而消除
亚克隆和SSDNA救援的需求。5
此外，QuikChange
闪电现场定向诱变试剂盒不需要专门的
载体，*的限制位点，多重转化或体外
甲基化处理步骤。简单、快速的三步程序需要
仅在转化前1小时（对于小于等于5 kb的质粒），以及
在单一反应中产生效率大于85%的突变体（参见
图1）。
Quikchange闪电酶是一种新型的专有技术混合物
包括pfuultra高保真（hf）DNA聚合酶**的衍生物
两条质粒链的诱变引物定向复制
高保真度。所有的基本程序都采用了超螺旋双绞线。
一个感兴趣的插入物和两个合成物的DNA（dsdna）载体
寡核苷酸引物，均含有所需的突变（见图1）。
寡核苷酸引物，每个引物与
载体，在温度循环过程中被pfuultra-hf-dna扩展。
聚合酶，无底物置换。寡核苷酸的延伸
引物产生含有交错缺口的突变质粒。跟随
温度循环，产品经DPN I处理。
内切酶（靶序列：5´-GM6ATC-3´）对甲基化有特异性。
半甲基化DNA，用于消化亲本DNA模板
并选择含有合成DNA的突变。6（DNA分离
几乎所有的大肠杆菌菌株都是DAM甲基化的，因此对
含有所需突变的刻痕载体DNA。
然后转化为XL10金超能力细胞。
注意，质粒DNA从几乎所有常用的
大肠杆菌菌株（DAM+）是甲基化的，是
突变，质粒DNA从特殊的DAM中分离出来-
包括JM110和SCS110在内的大肠杆菌菌株不适用。
不需要的第二位点错误几乎被消除，高突变
由于该方法的高保真度，
pfuultra-hf-dna聚合酶，使用少量起始dna
模板和使用的热循环次数少。
QuikChange Lightning Site定向诱变试剂盒可用于
点突变，替换氨基酸，删除或插入单个或
多种相邻氨基酸。该试剂盒已用质粒进行了优化。
大小从4到14 KB不等。

* NOS的美国专有技术。6734293 6444428 6183997和5948663；；；。DNA聚合酶有HF会pfuultra 18倍比Taq DNA合成的高逼真度
DNA聚合酶。
7
控制quikchange闪电诱变
在pwhitescript 4.5-kb控制质粒是用来测试的效率
代突变质粒使用网站定向quikchange闪电
诱变试剂盒。在pwhitescript 4.5-kb质粒包含停止控制
密码子TAA密码子谷氨酰胺在位置（CAA）的其中一个
通常出现在β-半乳糖苷酶基因的质粒pBluescript II SK（-）
噬菌粒（9相应到氨基酸的蛋白质）。xl10金
ultracompetent细胞转化质粒与本控制上出现白色
lb–ampicillin琼脂板（湖的制备和研究——媒体）
含有IPTG和X-gal，因为β-半乳糖苷酶的活动。
obliterated。创建一个寡核苷酸控制点突变在primers
一个reverts pwhitescript 4.5-kb控制质粒的T残留的停止
在密码子的氨基酸（TAA）的β-半乳糖苷酶基因的9个残基的C，
生产的谷氨酰胺密码子（CAA）发现野生型序列。
以下screened殖民地可以转化为β-半乳糖苷酶
（β-半乳糖+）表型的媒体上的蓝色的颜色含有IPTG和X-gal染色。

 

底漆设计指南
本方案中使用的致突变寡核苷酸引物必须是
根据所需的突变单独设计。以下
设计诱变引物时应考虑：
♦两个诱变引物都必须包含所需的诱变和
在质粒的相反链上退火到相同的序列。
♦底漆的长度应在25至45个底座之间，并熔化。
温度（tm）≥78°C。可使用长度超过45个碱基的底漆，
但使用较长的引物会增加二次结构的可能性。
从而影响诱变反应的效率。
下列公式通常用于估算
引物：Tm = 81.5 + 0.41(%GC) − (675/N) − % mismatch
计算tm时：

•n是底材中的底漆长度
•%gc和%mismatch的值是整数
用于计算用于引入插入或
删除，使用上述公式的修改版本：
81.5+0.41%（gc）（675/）tm=−n
其中n不包括插入或删除的基

所需的突变（缺失或插入）应在
底漆两边各有大约10-15个正确顺序的底座。
♦底漆的低GC含量应为40%，并且
应以一个或多个C或G基终止。
♦引物不需要5´磷酸化。
tm=81.5+0.41%（gc）−（675/n）−不匹配百分比
九
♦对于典型的诱变引物，脱盐纯化通常是
足够的。对于长的或复杂的诱变引物，纯化
液相色谱法（PLAC/FPLC）或聚丙烯酰胺凝胶
电泳（PAGE）可显著增加
诱变效率。
其他底漆注意事项
♦诱变方案使用每个寡核苷酸引物125 ng。
要将纳克转化为低聚物的皮摩尔，请使用以下方法
方程式：

保持底漆浓度过高很重要。我们建议
改变模板量，同时保持
底漆经常过量。
 协议
突变链合成反应（热循环）
注意确保质粒DNA模板从DAM中分离出来。+
大肠杆菌菌株。大多数常用的大肠杆菌菌株
是大坝+。从DAM菌株（如JM110）分离出质粒DNA
SCS110）不适用。
为了大限度地提高温度循环性能，我们
建议使用薄壁管，确保理想接触
温度循环器的热阻。以下协议
使用薄壁管进行优化。
1。合成两个包含所需的
突变，两侧是未修改的核苷酸序列。净化这些
在以下步骤中使用前的寡核苷酸引物（参见
诱变引物设计）。
2。准备控制反应如下：
5微升10×反应缓冲液
pwHitescript 4.5-kb控制质粒5μl（25 ng）（5 ng/μl）
1.25微升（125 ng）寡核苷酸对照引物1
[34摩尔（100 ng/微升）]
1.25微升（125 ng）寡核苷酸对照引物2
[34摩尔（100 ng/微升）]
1微升dntp混合物
1.5微升液体试剂
34微升DDH2O（使终反应体积达到50微升）
然后添加：
1微升Quikchange闪电酶
三。制备样品反应，如下所示：
注：使用不同数量的
dsdna模板范围从10到100 ng（例如，10，25，50，
和100 ng dsdna模板）同时保持引物
浓度常数。
5微升10×反应缓冲液
dsdna模板的xμl（10–100 ng）
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）1
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）2
1微升dntp混合物
1.5微升液体试剂
DDH2O，终体积为50μl

然后添加：
1微升Quikchange闪电酶
十一
4。使用表1中列出的循环参数循环每个反应。
（对于控制反应，延长2.5分钟。）
表一
定向QuikChange闪电场地的循环参数
诱变方法

 

例如，5-kb质粒在68°C条件下每个周期需要2.5分钟。

 

DPN I放大产物的消化
1。直接将2微升提供的DPN I限制酶添加到每个
放大反应。
注：仅使用所提供的DPN I酶；不得用
另一种来源的酶。
2。轻轻和*地混合每个反应混合物
上下解决方案多次。简单地降低反应速度
混合物，然后立即在37°C下培养5分钟以消化。
亲本（即非突变的）超压缩dsdna。
XL10金超能力细胞的转化
注意：在继续之前，请阅读转换指南。
转换协议。
XL10金细胞对四环素和
氯霉素。如果突变质粒只含有tetr
或抗camr标记，一种有能力细胞的替代品系。
必须使用。
1。在冰上轻轻融化XL10金超能力细胞。对于每一个
待转化的对照反应和样品反应，等分45微升
14 ml bd falcon聚丙烯的超能力细胞
圆底管。
2。将随试剂盒提供的2μlβ-Me混合物添加到45μl的
细胞。（使用β-Me的替代来源可能会减少转化
效率。
三。轻轻地旋转管中的内容物。在冰上培养细胞
2分钟。

4。从每个对照品和样品中转移2微升经dpn i处理的DNA。
对分离部分超能力细胞的反应。
作为可选控制，验证
通过添加1微升0.01 ng/微升puc18的XL10金超能力细胞
对照质粒（在水中稀释1:10的对照品）
另一个45-微升的小份细胞。
5。轻轻旋转转化反应，混合和培养
冰上反应30分钟。
注：此步骤的培养时间可缩短至
10分钟，转换过程中无重大损失
效率。
6。在A中预热NZY+肉汤（见介质和试剂的制备）
步骤9中使用的42°C水浴。
注：XL10金超能力细胞的转化
使用NZY+肉汤优化。
7。在42°C水浴中加热脉冲管30秒。持续时间
热脉冲对获得率至关重要。做
不超过42°C。
注：该热脉冲已优化用于
14毫升bd falcon聚丙烯圆底管。
8。在冰上孵育试管2分钟。
9。向每个试管中加入0.5毫升预热（42°C）NZY+肉汤，然后孵化。
管道在37°C下振动1小时，转速为225–250转/分。
十三
10。将每个转化反应的适当体积，如
下表所示，在含有适当
质粒载体的抗生素。
对于诱变和转化控制，将细胞传到
LB-氨苄西林琼脂平板，含80μg/ml x-gal和20 mm IPTG
（参见准备用于彩色筛选的琼脂板）。
转化反应电镀量

 

当电镀体积小于100μl时，在
琼脂平板，用移液管将小体积的转化反应移入池中，然后
摊铺混合物。
B撒布量根据
诱变质粒。通常对整个变换混合物进行电镀是有用的，
分为多个板，覆盖一系列电镀体积。
11。将转化板在37°C下培养16小时以上。
控件转换的预期结果
pwhitescript转换后的预期菌落数
4.5kb对照诱变反应>100个菌落。大于85%
菌落应含有突变，并在琼脂上呈蓝色菌落。
含有IPTG和X-Gal的板。
注意pwitescript 4.5-kb的诱变效率（Me）
对照质粒的计算公式如下：

 

如果对puc18控制质粒进行转化，
>应观察到50个菌落（>109 cfu/μg），其中>98%的菌落具有
蓝色表型。
样本转换的预期结果
预期菌落数取决于基组分和长度。
使用的DNA模板。关于增加殖民地的建议
编号，请参阅故障排除。插入感兴趣的内容应排序为
验证所选克隆是否包含所需的突变。

转型指导方针
储存条件
超能力细胞对温度的微小变化很敏感。
必须存放在-80°C冰箱的底部。从传输管道
一个冷冻室到另一个冷冻室可能会导致效率下降。超级电容器
电池应直接从干冰运输容器放置在-80°C。
对齐单元格
配药时，应始终将超能力细胞放在冰上。这是必要的。
把bd falcon聚丙烯管放在电池前的冰上
解冻后，细胞被直接分配到预成丘的试管中。
14毫升bd falcon聚丙烯圆底管的使用
重要的是14毫升bd falcon聚丙烯圆底管
（BD Biosciences Catalog_）用于转换协议，
因为其他试管可能会被β-巯基乙醇降解
转换协议。此外，热脉冲步骤的持续时间为
关键，并针对厚度和形状进行了专门优化
这些管子。
β-巯基乙醇的使用
β-巯基乙醇（β-Me）可以增加转化率。
效率。该试剂盒中提供的XL10金β-巯基乙醇混合物是
稀释后即可使用。
添加的DNA数量
当添加2μl合成物时，观察到大效率。
反应。当添加一个
尽管总效率可能
低一些。
热脉冲的长度和温度
有一个由热量产生的效率高的限定窗口。
转换过程中的脉冲。在细胞中观察到效率。
热脉冲30秒。不得超过42°C。
彩色筛选用琼脂板的制备
准备用于蓝白筛选的LB琼脂平板，添加80μg/ml。
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal），20 mm
异丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG），以及适当的
LB琼脂的抗生素。或者，100μl的10 mm IPTG和100μl
2%的x-gal可以在电镀前30分钟在LB琼脂板上涂抹。
转变。用无菌的DH2O制备IPTG；用
二甲基甲酰胺（DMF）。之前不要混合IPTG和X-GAL
用移液管把它们移到盘子上，因为这些化学物质会沉淀。

 

故障排除
当根据本说明手册中概述的指南使用时，此套件提供可靠的
使用dsdna模板进行定点突变的方法。基础成分的变化
DNA模板的长度和热循环性能可能导致
诱变效率。