TECOmedical 总人脂联素 ELISA说明书
TECOmedica TE1013使用说明书英文
TECO® 肾上腺髓质素 ELISA 试剂盒
TECO® 总人脂联素 ELISA 试剂盒
提供的试剂和材料：
符号 描述 格式
1 抗体包被微孔 1 板
一帧中 8 个孔的 12 个分离条（总计 12 x 8），即用型
A 标准品 A 1 x 0.75 mL
2 ng/mL-冻干
B 标准品 B 1 x 0.75 mL
10 ng/mL-冻干
C 标准品 C 1 x 0.75 mL
30 ng/mL-冻干
D 标准品 D 1 x 0.75 mL
70 ng/mL-冻干品
E 标准品 E 1 x 0.75 mL
100 ng/mL-冻干
L 对照 1 1 x 0.5 mL
ng/ml– 冻干品，范围如数据表所示
H 对照 2 1 x 0.5 mL
ng/ml– 冻干品，范围如数据表所示
2 稀释缓冲液 1 x 25 mL
即用型
3 抗体 HRP 结合物 1 x 12 mL
即用型
4 TMB 底物 1 x 12 mL
即用型
5 清洗缓冲液 1 x 50 mL
20 倍浓缩
7 微量滴定板粘合剂盖 贰件
套件说明 1 x3 TECOmedical
储存
将试剂盒储存在 2-8 ℃ 下。请勿冷冻。将未使用的试剂储存在 2-8 ℃ 下。
使用说明书
TECO® 总人脂联素试剂盒是一种灵敏的“双位点”夹心酶联免疫吸附体外试验，用于定量测定人血浆和血清中的脂联素。
临床应用
- 肥胖
- 动脉硬化
- 能量代谢
- 冠心病
- 多囊卵巢综合征
脂联素是一种分子量为 30 kDa 的蛋白质，占血清蛋白的 0.01%。主要由脂肪细胞合成，但肌肉细胞和肝细胞也具有合成脂联素的能力。直到现在，IGF-I 是已知的合成天然诱导剂。它由胶原蛋白样 N 末端和球状 C 末端结构域组成 [1]。体内脂联素以不同的低聚物出现。除三聚体和三聚体外，还存在高分子多聚体 [1～3]。到目前为止，已知有两种不同的受体，两种受体普遍表达，尽管在组织中的分布各不相同。脂联素受体 1 (AdipoR1) 尤其在肝组织的肌肉和 AdipoR2 中合成 [4]。
对人类有机体的意义直到现在还不*清楚。初的研究表明，脂联素与 BMI 呈负相关，因此它可能与能量代谢相关，例如通过调节脂肪酸氧化。除了与 BMI 相关外，脂联素水平还与胰岛素抵抗相关 [5-7]，因此也与 II 型糖尿病相关。脂联素也与葡萄糖和脂肪代谢相关 [8,9]。
如重复描述，在三种检测系统的比较研究中无法证明高分子多聚体的特殊诊断意义 [10]。
此外，脂联素参与炎症过程 [11-15]，并对 动脉硬化 [4，5，16] 和冠状动脉炎 [17，18] 的出现。因此，测定血浆中的脂联素水平可用于估计冠状动脉疾病的风险 [19,20]。除此之外，脂联素还影响进一步的生理过程，例如血管生成 [21,22]。
4
参考文献
[1] Nakano,Y. 等人
GBP28（一种从人血浆中纯化的新型明胶结合蛋白）的分离和表征。
J Biochem（东京）。1996;120 (4) :803-812.
[2] Pajvani,U.B.,et al.
脂肪细胞分泌激素 Acrp30/脂联素的结构-功能研究。对代谢调节和生物活性的影响。
《生物化学杂志》2003;278 (11) :9073-9085.
[3] Tsao,T.S. 等人
二硫键在 Acrp30/脂联素结构和信号特异性中的作用。不同的寡聚体激活不同的信号转导通路。《生物化学杂志》2003;278 (50) :50810-50817.
[4] Shimada,K.,T. Miyazaki,and H. Daida Adiponectin and atherosclerotic disease.Clin Chim Acta.2004;344 (1-2) :1-12.
[5] Higashiura,K. 等人
日本男性人群脂联素水平与胰岛素抵抗和动脉粥样硬化的相关性。
临床内分泌 (Oxf)。2004;61 (6) :753-759.
[6] Spranger,J. 等人
脂联素与多囊卵巢综合征妇女的胰岛素敏感性独立相关。
临床内分泌 (Oxf)。2004;61 (6) :738-746.
[7] Zoico,E. 等人
老年男性和女性的脂肪细胞因子、脂肪分布和胰岛素抵抗。
J Gerontol ABiol Sci Med Sci.2004;59 (9) :M935-939.
[8] Ye,J.M. 等人
pparα/γragaglitazar 可消除脂肪肝并增强胰岛素作用
在无肝肿大的脂肪饲喂大鼠中。
Am JPhysiol Endocrinol Metab.2003;284 (3) :E531-540.
[9] Yamauchi,T. 等人
脂联素通过激活 AMP-活化蛋白激酶刺激葡萄糖利用和脂肪酸氧化。
Nat Med.2002;8 (11) :1288-1295.
[10] Blüher (Blueher) ,M. 等人
总脂联素和高分子量脂联素与基线代谢变量和运动治疗计划的反应的关系：三种检测方法的比较评价。糖尿病护理。2007;30 (2) :280-285.
[11] Delaigle,A.M. 等人
炎性细胞因子对骨骼肌脂联素的诱导：体内和体外研究。
内分泌科。2004;145 (12) :5589-5597.
[12] Winzer,C. 等人
既往妊娠糖尿病妇女的血浆脂联素、胰岛素敏感性和亚临床炎症。
糖尿病护理。2004;27 (7) :1721-1727.
[13] Xydakis,A.M. 等人
肥胖个体中脂联素、炎症和代谢综合征的表达：通过热量限制快速减肥的影响。
临床内分泌代谢杂志。2004;89 (6) :2697-2703.
[14] Motoshima,H. 等人
脂联素抑制氧化 LDL 处理的内皮细胞增殖和超氧化物生成，增强 eNOS 活性。
生物化学生物物理学研究。2004;315 (2) :264-271.
[15] Wolf,A.M. 等人
脂联素诱导人白细胞中的抗炎细胞因子 IL-10 和 IL-1RA。
生物化学生物物理学研究。2004;323 (2) :630-635.
[16] Okamoto,Y. 等人
脂联素可减少载脂蛋白 E 缺陷小鼠的动脉粥样硬化。
循环。2002;106 (22) :2767-2770.
[17] Schlegel,A.
脂联素与冠心病风险。
Jama.2004；292 (1)：40；作者回复 40。
[18] Choi,K.M. 等人
既往未诊断为糖尿病的急性心肌梗死患者的炎症、胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受。
临床内分泌代谢杂志。2004 年。
[19] Nakamura,Y. 等人
冠心病患者血浆脂联素浓度的意义。
心脏。2004;90 (5) :528-533.
[20] Pischon,T.,et al.
男性血浆脂联素水平与心肌梗死风险。
Jama.2004;291 (14) :1730-1737.
[21] Shibata,R.,et al.
脂联素通过刺激 amp-活化蛋白激酶信号刺激组织缺血刺激血管生成。
《生物化学杂志》2004;279 (27) :28670-28674.
[22] Fernandez-Real,J.M.,et al.
脂联素与血管功能相关，与胰岛素敏感性无关。糖尿病护理。2004;27 (3) :739-745.
5 TECOmedical
试验原理
Adiponectinisaso 的 teco® 检测试剂盒称为 Sandwich-Assayusingtwospecificandhighaffinitymonoclonal antibodies。样本中的脂联素与包被在微量滴定板上的抗体结合。在下一步中，第二种特异性抗脂联素抗体依次与固定的脂联素结合。第二种抗体生物素化，并与链霉亲和素-过氧化物酶-酶结合物在混合物中孵育。在关闭底物反应中，根据样品的脂联素水平，将定量催化颜色的变化。
需要但未提供的材料
• 能够分配 5 μL、40 μL、80 μL、100 μL、320 μL、350 μL、500 μL、560 μL 和 750 μL 的移液器
• 用于复溶或稀释试剂的量筒
• 手动抽吸系统和多通道移液器或自动清洗器
• 蒸馏水
• 涡旋混合器
• ELISA 酶标仪适用于 96 孔板，能够在 450 和 405 nm 处测定（参比波长：590–650 nm）。
• ELISA 板振荡器 (350 rpm)（定轨振荡器）
• 用于数据生成和分析的软件包
警告和注意事项
本试剂盒仅供专业人员在体外使用。
认真遵循说明。
观察标签上注明的失效日期和复溶试剂的规定稳定性。更详细的安全信息请参见“材料安全数据表”。本试剂盒制备中使用的人源材料已经过检测，发现对 HIV-1 和 HIV-2 以及 HCV 抗体和 HbsAg 无反应性，但应视为具有潜在传染性进行处理。TECOmedical AG 对于因未遵守试剂盒说明造成的损失或伤害不承担任何责任。
1. 用于体外诊断。
2. 将所有样本视为具有潜在生物危害性的材料。处理本试剂盒内容物和任何患者样本时，请遵循一般注意事项。
3. 应按照联邦和当地法规要求处置容器和未使用的内容物。
4. 在包装标签上注明的失效日期之前，使用提供的试剂作为一个整体。请勿使用明显损坏或被微生物污染或溢出的材料。
5. 按照指示储存测定试剂。
6. 如果包装袋被刺破，请勿使用涂层条。
7. 每份样品重复检测两次。
8. 建议使用多通道移液器或重复移液器，以确保液体的及时输送。
9. a) 0,2m 硫酸具有腐蚀性，可引起严重烧伤。
b) 小心处理 TMB。
Do 不 摄入。 避免 接触 与 皮肤， 眼睛， or 衣物。 If 接触 is 制成， 清洗 与 水。 如果摄入，请就医。
10. 使用 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合物作为防腐剂 (< 0.015%)。
请勿摄入。避免接触皮肤、眼睛或衣物。如果发生接触，用水清洗。如果摄入，请就医。
6
试剂制备
1 包被抗人脂联素抗体的微量滴定板
将 12 个分离条（共 8 个孔，共 96 个）分隔成一帧，并密封在铝箔袋中。将条带孔牢固地装入框架中。打开后，立即返回 任何 未使用 孔 to 的 原始 箔 包装 和 密封。 在 2–8 ℃ 下储存至失效日期。初次开启后，组件的有效期为 4 周。
A 标准至5 瓶含天然脂联素（2、10、30、70 和 100 ng/mL）的冻干标准品。复溶
各 E 标准 与 750 μl of 稀释度 缓冲液。 保存 复溶 试剂 at 房间 温度 15 min，然后用涡旋器轻轻混合（无泡沫！）。复溶后，标准品可在-20 ℃ 下稳定储存 1 个月。仅一个冻融循环或等分保存。冻干品在 2-8 ℃ 下储存。
L 质控品 1
1 瓶冻干对照品（人血清）。用 500 μL 稀释缓冲液复溶。将复溶试剂在室温下放置 15 min，然后用涡旋器轻轻混合（无泡沫！）。复溶后，质控血清在-20 °C 条件下可稳定储存 1 个月。仅 1 个冻融循环或等分保存。有关精确值，请参阅数据表。冻干品在 2-8 ℃ 下储存。
H 对照 2
1 瓶冻干对照品（人血清）。用 500 μL 稀释缓冲液复溶。将复溶试剂在室温下放置 15 min，然后用涡旋器轻轻混合（无泡沫！）。复溶后，质控血清在-20 °C 条件下可稳定储存 1 个月。仅 1 个冻融循环或等分保存。有关精确值，请参阅数据表。冻干品在 2-8 ℃ 下储存。
2 稀释缓冲液
125 mL 1 支，即用型。缓冲液中可能存在沉淀，使用前通过混合和/或加热解决。在 2–8 ℃ 下储存至失效日期。初次开封后，组件的失效日期 保证 4 周。
3 抗体-HRP 结合物
1 瓶 12 mL，即用型。辣根过氧化物酶标记的抗人脂联素。在 2–8 ℃ 下储存至失效日期。初次开启后，组件的失效日期为 4 周。
4 TMB 底物
1 瓶 12 mL。备用。在 2–8 ℃ 下储存至失效日期。初次开启后，组件的有效期为 4 周。
5 清洗缓冲液
1 瓶 50 mL 缓冲液。缓冲液中可能存在沉淀，使用前通过混合和/或加温使小瓶内容物用蒸馏水补足至 1000 mL 解决。稀释后的洗涤液在 2–8 °C 下可稳定储存 4 周。未稀释的洗涤液在 2–8 °C 下储存直至失效日期。初次开启后，组件的有效期为 4 周。
6 终止液 –0.2 MH2SO4
- 12 mL 0.2 MH2SO4 小瓶。备用。在 2–8 ℃ 下储存至失效日期。初次开启后，组件的有效期为 4 周。
7 微量滴定板盖
- 碎片、粘合剂。
7 TECOmedical
血清样本的制备和稳定性
样本类型
建议空腹采集血样。人血清或血浆、乳汁、尿液、CSF 和 细胞 培养。在血清和肝素血浆中发现了相似的值，但在 EDTA 和柠檬酸盐血浆中，样本值为 降低 18%。
脂联素：
血清与 EDTA 血浆 –5 种不同检测中的 20 份样本
稳定性
- 室温下多 2 天
- Maximum 2 years at -20 °C 下长 2 年
- 多 3 个冻融循环
注
样品必须用稀释缓冲液稀释。样品稀释后的样品稳定性：多 1 小时 20-25 ℃ 下
大多数情况下（对于血清或血浆样本，如果预期无极值），用稀释缓冲液以 1:200 至 1:1600 的稀释度应该是合适的。根据预期的脂联素水平，稀释度可能较高或较低。除血清或细胞培养上清液外，人源体液中的脂联素浓度可能*不同。
一般而言，血清或血浆样本的 1:300 稀释因子适用于临床诊断。样品稀释后的样品稳定性：20-25 ℃ 下多 1 小时。
稀释方案建议：
- 一步稀释 (1:300)：
将 5 μL 样品稀释于 1.5 mL 稀释缓冲液中
- 两步稀释 1:300：
1. 向 560 μL 稀释缓冲液中加入 40 μL 血清或血浆，按 1:15 稀释（建议在较大系列中应用多步进器）。
2. 然后将 20 μL 充分混合的一份稀释液加入 380 μL 稀释缓冲液中。混合后，使用 2 × 100 μL
来自试验中的该稀释样品。
|
推荐的样品稀释度： |
• 血清/血浆： |
1:300 或更高 |
|
|
• 母乳： |
1:2 to 1:10 |
|
|
• 尿液： |
1:2 to 1:10 |
|
|
• 唾液： |
1:2 to 1:10 |
|
|
• 脑脊液： |
1:2 to 1:10 |
|
|
• 细胞培养： |
1:5 to 1:200 |
8
测定程序
所有测定（标准品、稀释的血清质控品和稀释的样本）应重复测定两次。进行测定时，应尽快 (< 15 min) 移取标准品、质控血清和样本。为避免由于孵育时间的差异导致的失真，应以与样品相同的顺序和相同的时间间隔向微孔板中加入 HRP 结合物、底物溶液和终止液。允许使用所有试剂 在室温 (20-25 ℃) 下静置至少 30 min。复溶后，将试剂在室温下放置 15 min，使用前轻轻混匀。
1. 准备框架和所需数量的涂层条 1。
2. 为标准品、对照品和样品分配微量滴定板的孔。
稀释样品，见第 8 页和对照品 (1:300)。
3. 移取 100 μL 稀释缓冲液 2，一式两份，置于微孔中（空白）。
4. 移取 100 μL 各标准品 (A-E)、稀释的对照血清（l 和 H）和样品（见稀释方案）至相应孔中。
5. 用密封胶带覆盖微孔，并在微孔板振荡器 (350 rpm) 上于室温 (20–25 ℃) 下孵育微孔板 1 小时
- 孵育后，使用洗板机吸取微孔，或通过倒置微孔板手动倾倒微孔。 用 350 μL 稀释的清洗缓冲液清洗微孔 3 次（每个循环孵育 15 秒）。后一次清洗循环后，在干燥的吸收剂表面上轻轻敲击倒置的微孔，以除去多余的清洗液。
7. 在每个孔中移取 100 μL 抗体 HRP 结合物 3。
8. 用密封胶带覆盖微孔，并在微孔板振荡器 (350 rpm) 上于室温 (20–25 ℃) 下孵育微孔板 30 min。
9. 按照步骤 6 所述，用清洗缓冲液清洗微孔 3 次。
10. 在每个孔中移取 100 μL TMB 底物溶液 4。
11. 在室温 (20-25 ℃) 下避光孵育平板 15 min。
12. 每孔加入 100µl 终止液 6。
13. 在 30 min 内测量 450 nm 处的显色反应（参考滤光片在 590–650 nm 之间）。具有强显色反应，例如 > 3 OD，也可在 405 nm 处测量。
不同自动 ELISA 系统的方案可用。
结果分析
为评价含量测定，空白的吸光度值应低于 0.25，标准品 E 的吸光度值应超过 1.0，对于吸光度值高于标准品 E 的样品，应使用更高的稀释度再次进行检测。以标准品浓度为 x 轴（线性标度），以标准品吸光度为 y 轴（线性标度），绘制标准曲线。然后可以从标准曲线上读取稀释患者血清中的脂联素浓度。应使用 4 参数曲线拟合进行自动数据简化。通过将标准曲线上读取的值乘以稀释因子获得样本和对照品的脂联素浓度。
质量控制
良好实验室 练习 要求 那 控制 是 包括 in 每个 含量测定。 A 统计学 显著 编号 的质控品应进行测定，以建立 平均值 数值 和 可接受 范围 to 保证 适当的表现。只有按照说明进行试验，试验结果才有效。此外，用户必须严格遵守 GLP（药物非临床研究质量管理规范）规则或其他适用联邦、州或当地标准/法律。所有标准品和试剂盒质控品必须在 QC 证书规定的可接受范围内。 如果不符合标准，则运行无效，应重复运行。各实验室应使用已知样本 作为进一步控制。
9 TECOmedical
450 nm 处的典型结果
（仅为示例。不用于计算实际结果）
*通过稀释因子 1:300 校正
对于每次测定，质控品的结果必须在每个批次指示的目标范围内。试剂盒提供了包含目标范围的 QC 方案。如果质控值不在目标范围限值内，则应将测定结果视为可疑，并应再次检测样本。
结果解释
检测结果不应成为治疗决策的依据。应根据既往病历、进一步临床观察结果和其他诊断研究的结果解释结果。此外，建议为每个实验室建立与相关患者组相对应的参考值和临界值。
程序限制
TECO 敏感的人脂联素 ELISA (TE1013) 基于单克隆抗体。通常，该技术对样本中的异嗜性抗体或风湿因子敏感。通过试验设计降低了其影响，但不能*排除。
10
参考值
使用 TECO®ELISA 试剂盒在健康供体中测定的血清脂联素预期值如下所示。这些数据显示脂联素-血清值与健康受试者的年龄和性别显著相关。反过来，各自 BMI 之间的相关性似乎不太显著。在新生儿脐带血样本中发现脂联素值*。
成人预期值，性别特异性
预期值，特定年龄
11 TECOmedical
与 BMI 相关的特定年龄和性别的预期值
BMI = 体重指数 (kg/m2)
12
测试性能
校准
试剂盒中的标准品由天然脂联素（人血清）制备，并根据重组蛋白进行定量。
精密度（批间）
（测定内）
检测限
+ 2 标准偏差时的检测下限 (LLOD) 为 < 0.27 ng/mL。
回收试验
血清基质中重组脂联素的回收率平均为 110%。
13 TECOmedical
稀释试验
干扰
向血清样本中加标不同浓度的可能干扰物质，测量脂联素的量，并与未加标的相同样本中的脂联素浓度进行比较。所有供试品均未对脂联素测定产生显著干扰。
交叉反应性
与以下种属无交叉反应：马、牛、鸡、兔、犬、豚鼠、绵羊、小鼠、山羊、驴、大鼠、猫、猪。
备注
本说明书引用的数据仅供参考。建议每个实验室在测定中包括自己的一组对照样本。为了遵循 GLP 指南，各实验室应建立自己的脂联素水平正常和病理范围。
TECO® 总人脂联素
测定程序-快速指南
|
盖上微孔板，置于振荡器 (350 rpm) 上，在 20–25 ℃ 下孵育 30 min |
|
抽吸并用 350 μL 清洗缓冲液清洗 3 次，在干净干燥的吸附剂表面上轻轻抽吸并轻敲倒置的微孔 |
|
向各孔中加入 100µl TMB 底物 4 |
|
在 20-25 ℃ 避光条件下孵育 15 min |
|
向各孔中加入 100µl 终止液 6 |
|
在 30 min 内测量 450 nm 处的吸光度 定量软件，4 参数拟合：y = (A-D)/(1 + (x/C) ^B) + D 应在 590–650 nm 处进行参考测量 |
使用快速指南前，请阅读试剂盒说明
标准曲线 艾克库尔 Courbe 标准
|
校准品 |
目标值 |
/Zielwerte/ |
Valeurs 出席 |
450 nm 消光 |
|
A |
2 |
ng/ml |
|
0.056 |
|
B |
10 |
ng/ml |
|
0.260 |
|
C |
30 |
ng/ml |
|
0.807 |
|
D |
70 |
ng/ml |
|
1.647 |
|
E |
100 |
ng/ml |
|
2.201 |
日期 04.06.2020