JC-1 线粒体荧光探针说明书

产品详情

产品描述

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)是利用 JC-1 作为膜电位识别的荧光探针，能够快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，用于早期的细胞凋亡检测。

JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm 的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其检测原理为：当JC-1 进入细胞后，正常细胞中线粒体膜电位较高，在此条件下 JC-1 会聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，进而产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时 JC-1 以单体存在，产生绿色荧光。实际使用过程中，我们通常通过比较红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的程度，方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很快速地捕捉到细胞膜电位的下降，同时红色到绿色荧光的转变也可以作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1 单体的最大激发波长为 515nm，最大发射波长为 529nm；JC-1 聚合物的最大激发波长为 585nm， 最大发射波长为 590nm。观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。

实验案例分析

图 1. 使用本试剂检测 A549 细胞在正常和造模前后的线粒体膜电位的实验效果图。正常 A549 细胞经JC-1 染色后以聚合物形式存在，呈明亮的红色荧光，绿色荧光很弱；使用 CCCP（10 μM）诱导使线粒体膜电位下降后，JC-1 以单体存在形式居多，因此线粒体内红色荧光强度显著降低，而绿色荧光显著增强。

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1))说明书

产品详情

产品描述

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)是利用 JC-1 作为膜电位识别的荧光探针，能够快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，用于早期的细胞凋亡检测。

JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm 的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其检测原理为：当 JC-1 进入细胞后，正常细胞中线粒体膜电位较高，在此条件下 JC-1 会聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，进而产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中， 此时 JC-1 以单体存在，产生绿色荧光。实际使用过程中，我们通常通过比较红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的程度，方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变，可以很快速地捕捉到细胞膜电位的下降；同时红色到绿色荧光的转变，也可以作为细胞凋亡早期的一个检测指标。JC-1 单体的最大激发波长为 515nm，最大发射波长为 529nm；JC-1 聚合物的最大激发波长为585nm，最大发射波长为 590nm。观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。本试剂盒提供 CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

产品组成

包装清单：

使用本试剂盒检测 A549 细胞在正常和造模前后的线粒体膜电位的效果图。正常 A549 细胞经 JC-1 染色后以聚合物形式存在，呈明亮的红色荧光，绿色荧光很弱；使用 CCCP（10μM）诱导使线粒体膜电位下降后，JC-1 以单体存在形式居多，因此线粒体内红色荧光强度显著降低，而绿色荧光显著增强。

运输与保存

-20℃避光保存，避免反复冻融。JC-1缓冲稀释液4℃保存，至少2周内有效。

实验步骤

1. JC-1 染色工作液的配制：

取适量 JC-1 (200X)，按照每 5µl +995 μl JC-1 缓冲稀释液（1X）的比例稀释至 1X JC-1 染色工作液。 注：试剂盒标配 JC-1 缓冲稀释液为 10X，使用前用三蒸水稀释至 1X 使用，配置前应于 37℃水浴至室温后方可使用，以免稀释液过冷染色过程对细胞有刺激影响实验结果，稀释时将JC-1 缓冲稀释液（1X）快速加入到 200X 的 JC-1 母液中稀释效果更佳。一般建议 6 孔板每孔使用 JC-1 染色工作液量为 1ml，其它培养器皿用量以此类推。对于细胞悬液每 5-10*106 细胞加 0.5ml JC-1 染色工作液（1X）。

2. 阳性对照组：

该试剂盒包含阳性对照 CCCP（10 mM），CCCP 可以诱导细胞线粒体膜电位变化。使用方法：用细胞培养液配制 CCCP，推荐终浓度为 10 µM，对于不同细胞 CCCP 浓度可自行调整。正常条件下，10 µM CCCP处理 20 分钟后线粒体的膜电位会明显改变，此时，JC-1 染色后可观察到明显的绿色荧光；相反，正常的细胞经 JC-1 染色后显示红色荧光。

3. 悬浮细胞处置：

a) 取5-10*106细胞，用0.5ml 细胞培养液重悬细胞。

b) 加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。置于细胞培养箱中37℃孵育20-30分钟；不同细胞根据实验可自行调整染色时间。

b) 孵育结束后，700g 4℃离心，收取沉淀细胞。

c) 用JC-1 缓冲稀释液（1X）洗涤 2-3 次：加入 1 ml JC-1 染色工作液重悬细胞，随后用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可用流式细胞仪分析。

4. 贴壁细胞处置：

a) 6 孔板贴壁细胞处理过程如下：首先，弃培养液，用常温 PBS 或培养液轻洗细胞2次，加入1ml新鲜细胞培养液。阳性对照组中加入CCCP（终浓度 10 µM）提前置于孵箱中处理20-30分钟；

b) 随后，加入1ml JC-1 染色工作液，充分混匀。置于培养箱中 37℃孵育30-60分钟不等（可根据实验情况调整）。

d) 孵育结束后，弃上清，用 JC-1 缓冲稀释液（1X）洗涤细胞 2 次。

e) 加入 1 ml 细胞培养液，于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5. 纯化的线粒体：

a) 1 ml 染色体系包含：0.9 ml JC-1 染色工作液+0.1ml纯化的线粒体 (10-100µg)；置于37℃孵育 20-30 分钟，期间可上下颠倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b) 孵育结束后，可用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：荧光分光光度计检测：激发波长为485nm，发射波长为 590 nm。荧光酶标仪检测时，激发波长可在 475-520 nm 范围内设置。具体可参考步骤6中的条件进行荧光检测。

c) 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同步骤6。

6. 荧光检测与数据分析：

JC-1 单体的激发波为 490 nm，发射光波长为 530 nm；JC-1 聚合物，激发波长为 525 nm，发射波长为

590 nm。实际测试过程中，可依据实验室仪器的相关参数进行设置，不必把激发和发射波长设置在最大激发波长和最大发射波长。荧光显微镜或共聚焦观察时，JC-1 单体的检测可参照其它绿色荧光时的设置，如GFP 或 FITC 通道；同理，JC-1 聚合物的检测时可以参考其它红色荧光，如碘化丙啶或 Cy3 的设置。因此， 出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，我们可以通过比较红绿荧光的相对比例衡量线粒体膜电位的变化。

注意事项

8. 注意事项：

a) JC-1 探针母液（A 试液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；尽量减少反复冻融。

b) JC-1  缓冲稀释液（B 试液）：如需无菌操作，使用前可用 0.2μm 滤膜过滤后装瓶使用即可。4℃保存，至少2周内有效。

  c) CCCP（C 试液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；尽量减少反复冻融。洗涤时也可以用 Hanks' Balanced Salt Solution、PBS 等替代JC-1 缓冲稀释液。